Публикации: Научно-популярные статьи

Приглашаем к участию в XII Всероссийской олимпиаде про нанотехнологиям!

ВВЕДЕНИЕ

Настоятельная необходимость отслеживать все аспекты состояния окружающей среды в реальном времени постоянно растет, и это вызвано возрастающими связями загрязнения окружающей среды с нашим здоровьем и безопасностью. Необходимо также иметь возможность определять содержание основных компонентов и примесей в различных средах. Именно поэтому можно сказать, что целью всей современной аналитической химии является снижение пределов обнаружения и повышение точности и надежности анализа. Современные приборы в аналитической химии становятся настолько сложными, что позволяют нам определять химические вещества в количествах меньших, чем это можно было бы даже представить всего несколько лет назад. Результаты контроля состояния окружающей среды показывают, что необходимо определять как основные, так и побочные продукты химической промышленности во всех областях окружающей нас среды.

Следствием столь насущной потребности в мониторинге всего, что нас окружает, является вовлечение огромной энергии и ресурсов в разработку сенсоров широкого спектра действия. Конечным результатом этой работы будет обеспечение нас однажды портативными, миниатюрными и интеллектуальными воспринимающими устройствами для мониторинга практически всего, что бы мы ни пожелали. Например, если речь идет о нашем здоровье, то в будущем можно представить себе, что у каждого из нас будет такое самодиагностирующее устройство размером с кредитную карточку со встроенными в него разнообразными химическими и биосенсорами, которое позволит нам в любой момент узнать все о состоянии нашего здоровья. Например, человеку нездоровится. Чтобы узнать причину, ему достаточно будет просто лизнуть чувствительную поверхность своего диагностического устройства - и немедленно на жидкокристаллическом дисплее загорится сообщение: “У Вас обнаружен вирус гриппа, примите аспирин и отдохните”.

Что касается мониторинга окружающей среды, то легко представить себе простые устройства, которые можно было бы использовать, скажем, для проверки загрязненности природных вод тяжелыми металлами или для обнаружения бактерий в питьевой воде, в бассейнах или на пляжах. Такими устройствами можно было бы снабдить ванны для проверки качества воды перед купанием. Конечно, это преувеличение - на самом деле наши возможности определяются химией, физикой и электроникой таких устройств, а также техническими возможностями конкретного времени. Не следует упускать из виду тот факт, что возможности всех этих воспринимающих устройств определяются в первую очередь уровнем развития фундаментальной науки. Разработка сенсоров является результатом совместных усилий химиков, биологов, физиков и инженеров-электронщиков и представляет собой поистине междисциплинарную область.

Все сенсоры можно разделить на две большие группы. Это физические сенсоры, реагирующие на такие параметры, как температура, давление, магнитное поле и силы, не являющиеся предметом исследования химии. Далее, это химические сенсоры, реагирующие на конкретные, специфические химические реакции, которые и будут подробно рассмотрены в данной работе.

ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ И УСТРОЙСТВО ХИМИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ

ХС состоит из химического селективного слоя датчика, дающего отклик на присутствие определяемого компонента и изменение его содержания, и физического преобразователя (трансдьюсера). Последний преобразует энергию, возникающую в ходе реакции селективного слоя с определяемым компонентом, в электрический или световой сигнал, который затем измеряется с помощью светочувствительного и/или электронного устройства. Этот сигнал и является аналитическим, поскольку дает прямую информацию о составе среды (раствора). ХС могут работать на принципах химических реакций, когда аналитический сигнал возникает вследствие химического взаимодействия определяемого компонента с чувствительным слоем, или на физических принципах, когда измеряется физический параметр (поглощение или отражение света, масса, проводимость). В первом случае чувствительный слой выполняет функцию химического преобразователя. Общая схема функционирования ХС изображена на рис. 1.

Для повышения избирательности на входном устройстве ХС (перед химически чувствительным слоем) могут размешаться мембраны, селективно пропускающие частицы определяемого компонента (ионообменные, диализные, гидрофобные и другие пленки). В этом случае определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану к тонкому слою химического преобразователя, в котором формируется аналитический сигнал на компонент. На основе ХС конструируют сенсорные анализаторы- приборы, предназначенные для определения какого-либо вещества в заданном диапазоне его концентраций. Эти анализаторы могут иметь малые габариты (иногда приближающиеся к размерам калькулятора или авторучки). Поскольку в их конструкции отсутствуют детали, претерпевающие механический износ, устройства характеризуются достаточно длительным сроком эксплуатации (до года и более). Объединенные в батарею и подключенные к компьютеру, ХС способны обеспечивать анализ сложных смесей и дать дифференцированную информацию о содержании каждого компонента. В сенсорных анализаторах встроенные микросхемы позволяют вводить поправки на изменение температуры, влажности, учитывать влияние других компонентов среды, проводить градуировку и настройку нулевого значения на шкале показаний.

ТИПЫ И КОНСТРУКЦИЯ ХИМИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ

В зависимости от характера отклика (первичного сигнала), возникающего в чувствительном слое ХС, последние подразделяют на различные типы (рис. 2). В настоящее время наибольшее распространение получили электрохимические ХС, и прежде всего амперометрические и потенпиометрические, хотя наблюдается неослабный интерес исследователей и разработчиков к другим типам ХС, в том числе и оптическим. В электрохимических сенсорах (ЭХС) определяемый компонент реагирует с чувствительным слоем непосредственно на электроде или в объеме слоя раствора около электрода. Например, для определения концентрации СО₂ в воздухе используют кондуктометрические ХС. Их действие основано на измерении электропроводности водного раствора углекислоты, в котором, как правило, в результате ее диссоциации образуются ионы H⁺ и HCO₃^- в количествах, зависящих от парциального давления CO₂ в воздухе. Различие в электропроводности между холостым раствором (без СО₂) и анализируемым фиксируется как аналитический сигнал. Селективность амперометрического сенсора определяется природой материала электрода, точнее, его поверхности, а следовательно, и величиной потенциала, при котором происходят электрохимические реакции с участием анализируемого компонента.

К сожалению, не все вещества электрохимически активны к доступной области потенциалов. Кроме того, многие вещества реагируют на электродах при крайне отрицательных или положительных потенциалах. При этом аналитический сигнал может быть искажен или плохо воспроизводим. Для уменьшения влияния этих факторов и повышения селективности отклика поверхность ХС модифицируют с помощью специальных соединений, которые осуществляют перенос электронов между электродом и определяемым компонентом при меньших потенциалах. Операция закрепления модификатора-переносчика на поверхности химического сенсора называется иммобилизацией. В ходе иммобилизации с помощью специальных реагентов модификатор либо вводят в пленку электропроводящего полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей, "пришивают" к собственно электроду-трансдьюсеру, либо удерживают на его поверхности за счет сил адсорбции. При этом модификатор перестает быть подвижным, не вымывается анализируемым раствором и может работать в потоке жидкости. Модификация электродов для сенсоров удлиняет срок их службы. Способы модификации электродов химическими реагентами для создания ХС подобны тем, которые используют в конструкциях биосенсоров [1].

Примером использования ХС на основе модифицированного электрода может служить задача определения диоксида азота NO₂ в воздухе, то есть в присутствии O₂. На обычных электродах обе молекулы этих газов восстанавливаются при близких потенциалах - их совместное присутствие мешает раздельному определению. На модифицированном фталоцианиновым комплексом кобальта электроде восстановление NO₂ происходит при невысоких потенциалах, при которых кислород "молчит". Генерируемый в ходе электродной реакции ток является аналитическим сигналом, который пропорционален концентрации NO₂ в воздухе.

Разработаны конструкции амперометрических ХС для анализа газов, в которых исключено использование проводящих ток растворов электролитов. В них применяются так называемые твердые электролиты, представляющие собой твердые растворы оксидов некоторых металлов. Потенциометрические ХС основаны на так называемых ионоселективных электродах, дающих селективный отклик на присутствие определяемых ионов или молекул веществ в растворах. Аналитическим сигналом в них является потенциал. Эти ХС функционируют обратимо, и при измерении потенциала на электроде не нарушается электрохимическое равновесие электрод (ХС) - раствор, чего нельзя сказать об амперометрических ХС, отклик которых определяется электролизом, то есть потреблением вещества. Однако расход определяемого вещества за время проведения анализа (так называемого формирования отклика) настолько ничтожен, что не вызывает изменений концентрации определяемого компонента при повторных измерениях. Чувствительность отклика потенциометрических ХС, как правило, ниже амперометрических.

Среди ЭХС получили распространение миниатюрные устройства, основанные на полевых транзисторах. В них металлический контакт затвора транзистора заменен химически чувствительным слоем и электродом сравнения. В этом случае затвор представляет собой металлический слой, покрытый чувствительным материалом. Взаимодействие определяемого компонента с материалом затвора вызывает изменение электрического поля в области затвора и, следовательно, порогового потенциала и тока в транзисторе, что и обусловливает аналитический сигнал. Эти устройства чувствительны к некоторым газам, например: H₂, NH₃, CH₄, H₂S, с пределом обнаружения до 10^-4-10^-5 %. Из последних достижений в конструировании ЭХС можно отметить создание с использованием планарной технологии микросенсорных батарей на основе принципа ионоселективного электрода для определения концентрации ионов водорода и калия в кровотоке работающего сердца. Такие устройства могут найти применение в медицине, в частности при хирургическом вмешательстве в области миокарда.

Оптические ХС работают на принципах поглощения света, или отражения первичного светового потока, или возникающей люминесценции. Эти сенсоры выгодно отличаются от ЭХС тем, что нечувствительны к электромагнитным и радиационным полям и способны передавать аналитический сигнал без искажения на большие расстояния. Кроме того, они имеют невысокую стоимость по сравнению с ЭХС и могут конкурировать с последними, особенно в случаях, когда применение ЭХС неэффективно. Из оптических ХС перспективны сенсоры на основе волоконной оптики.

В волоконно-оптических сенсорах (ВОС) на торце световода закрепляется (иммобилизуется на каком-нибудь носителе по одному из способов, рассмотренному выше) реагентсодержащая фаза (РСФ). При описании таких устройств иногда используют термин "оптрод", являющийся комбинацией слов "оптика" и "электрод". Этим подчеркивается, что ВОС по своему назначению близок к электродам, в том числе и к тем, на основе которых функционируют ЭХС. Однако по природе сигнала и механизму отклика они совершенно отличны. Характеристика материала световода определяет оптический диапазон и соответственно аналитические возможности всего устройства. Если оптическое волокно изготовлено из кварца, то такой оптрод работает в широкой области спектра, включая ультрафиолетовую его часть. Для стекловолокна область длин волн охватывает лишь видимую область спектра. Если оптоволокно изготовлено из полимерного материала (такие устройства имеют невысокую стоимость), то диапазон длин волн, в которой работает ВОС, находится за пределами >450 нм.

Оптосенсоры могут быть обратимыми и необратимыми. Сенсор обратим, если РСФ не разрушается при ее взаимодействии с определяемым веществом. Если часть реагента потребляется в ходе определения, сенсор работает необратимо.

На рис. 3 приведена схема формирования отклика обратимого ВОС для определения pH среды, основанного на поглощении света. Устройство такого сенсора является достаточно простым: два пластиковых волокна вмонтированы в целлюлозную трубочку, содержащую краситель фиолетовый красный, иммобилизованный с помощью ковалентного связывания на полиакриламидных микрошариках. Кроме этих микрошариков внутрь трубочки помешены такого же размера шарики из полистирола для лучшего рассеяния света. Через одно волокно свет от вольфрамового источника излучения входит, а через другое выходит. Интенсивность выходящего потока света измеряется детектором, настроенным на соответствующую область длин волн. Пробка на торце трубочки удерживает РСФ механически и препятствует ее взаимодействию с определяемым компонентом в торцевой части. Подобный оптрод может быть использован и для определения концентрации O₂. В этом случае сигнал связан с тушением флуоресценции реагента при взаимодействии с кислородом. Такого типа оптроды могут быть использованы и для определения pH в живом организме.

Необратимые оптроды из-за расходования РСФ имеют ограниченный срок службы. Однако его можно продлить заменой РСФ на новую фазу. Стабильный сигнал от этих ВОС может быть получен лишь в условиях стационарного массопереноса определяемого компонента в зону его взаимодействия с РСФ. Любая помеха, нарушающая массоперенос, дает ошибку в показаниях ВОС. Обратимые и необратимые ВОС отличаются друг от друга так же, как потенциометрические ХС от амперометрических. Для последних условия массопереноса в зону реакции с чувствительным слоем определяют стабильность отклика.

На рис. 4 показана схема работы необратимого оптрода на кислород. Определяемый компонент диффундирует через селективную мембрану с соответствующим размером пор в полость, содержащую иммобилизованный флуоресцирующий краситель. Его свечение гасится в присутствии O₂ пропорционально парциальному давлению кислорода. Степень гашения фиксируется соответствующим устройством. Если резервуар с РСФ достаточно велик, то потребление реагента незначительно и сенсорное устройство может служить долго. Из других типов ХС следует упомянуть электрические (ЭС) и сенсоры, основанные на принципах пьезоэффекта. При конструировании ЭС на поверхность преобразователя-полупроводника наносится адсорбционный слой специального материала, дающий отклик на присутствие определяемого компонента. Для изготовления полупроводниковой части этих ЭС используют различные оксиды металлов (SnO₂, In₂O₃,Nb₂O₅ в ЭС на оксид углерода, аммиак). Принцип действия таких ХС основан на изменении их электрической проводимости в присутствии молекул определяемого газа. В воздухе на нагретой поверхности оксидного полупроводникового материала происходит хемосорбция молекул кислорода. При этом образуются отрицательно заряженные ионы O₂ с локализацией на них электронов из зоны проводимости полупроводника. Предполагается, что электропроводность полупроводникового слоя в воздухе определяется степенью заполнения поверхности хемосорбированным кислородом. В присутствии определяемого газа на поверхности полупроводника происходит окисление молекул этого газа. При этом степень заполнения поверхности молекулами кислорода изменяется пропорционально концентрации определяемого газа. Введением в состав металлоксидных сенсоров легируюших добавок добиваются высокой селективности отклика. Например, легирование оксида олова платиновой или палладиевой чернью заметно повышает чувствительность сенсора к парам этанола. Эти сенсоры могут быть изготовлены по технологии микросхем, когда чувствительный слой формируется на одном кристалле вместе с электрической цепью усилителя и детектора, что позволяет обра­батывать аналитический сигнал сенсора непосредственно в месте его возникновения. Существуют подобные ЭС на O₂, NO_x, H₂S, СО, Н₂, углеводороды, позволяющие определять их содержание на уровне 10^-5%.

Использование принципа пьезоэффекта для формирования сигнала сенсора можно продемонстрировать на примере ХС на пары ртути. Известно, что между изменением частоты колебаний кварцевого пьезорезонатора и массой адсорбированного на его поверхности вещества существует линейная зависимость:

∆F=-2,3 10⁶F²∆m/S, где F - резонансная частота колебаний пьезоэлемента, МГц; S- площадь электрода пьезоэлемента, см²; ∆m- масса адсорбированного на поверхности электрода вещества, г.

Если пластину кварца покрыть тончайшим слоем золота, которое легко образует амальгаму под воздействием паров ртути, то при измерении резонансной частоты такого устройства можно определить массу ртути на пластинах, а следовательно, и концентрацию ее паров. В случае возникновения необходимости определять другие компоненты в газовой фазе используют соответствующие химические реагенты, дающие селективный отклик на поверхности резонатора в присутствии этих веществ. Независимо от типа сенсоров к ним предъявляют высокие требования. Они должны обладать высокими селективностью и чувствительностью определения. Так, нижняя граница определяемых содержаний с использованием ЭС лежит в пределах 10^-4-10^-6%, а в отдельных случаях - еще ниже.

БИОСЕНСОРЫ

В последнее десятилетие возникли новые контакты на первый взгляд между очень далекими областями: электроникой и биохимией. Их взаимное проникновение друг в друга создало новую сферу интересов науки – биоэлектронику. Первым шагом в этой области было возникновение новых устройств для анализа и переработки информации, получивших название биосенсоров. Биосенсоры рассматриваются как первое поколение биоэлектронных устройств.

Биосенсоры - это аналитические устройства, использующие биологические материалы для "узнавания" определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Идея создания такого рода устройств существует уже около 30 лет. Впервые ее высказали, по-видимому, Кларк и Лионе в 1967 году [4]. Идея Кларка состояла в использовании ферментного электрода, то есть электрохимического датчика с иммобилизованным на его поверхности ферментом. За прошедшие десятилетия эта идея получила достаточное развитие. Создано и исследовано много систем, некоторые получили апробирование и промышленную реализацию.

Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных соединений. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно (количественно) определить концентрацию нужного соединения, например глюкозы. Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность. Любой биосенсор состоит из двух принципиальных функциональных элементов: биоселектируюшей мембраны, использующей различные биологические структуры, и физического преобразователя сигнала (трансдьюсера), трансформирующего концентрационный сигнал в электрический. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала. В качестве биоселектируюшего материала используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки (рис. 5).

Трансдьюсерами могут быть электрохимические преобразователи (электроды), различного рода оптические преобразователи, гравитационные, калориметрические, резонансные системы. Все виды биоселектируюших элементов можно комбинировать с различными трансдьюсерами. Это создаст большое разнообразие различных типов биосенсоров. Наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры.

БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТОВ

Ферментативный катализ обеспечивает биоселектирующими возможностями основную массу современных биосенсоров. Сопряжение ферментативно-каталитических и электрохимических реакции, происходящих на электропроводящих материалах, погруженных в раствор электролита, позволило разработать много биосенсоров для определения глюкозы, аминокислот, молочного сахара, пирувата, мочевины и других метаболитов.

Первая, предложенная Кларком, система основана на электроде, измеряющем в диффузионно-контролируемом режиме количество поглощенного кислорода. Было применено большое число оксидаз, использующих кислород для селективного окисле­ния углеводов, аминокислот, органических кислот. Наиболее удобно проводить измерения на ферментных электродах в амперометрическом режиме, то есть измерять силу тока (поток электронов) через поверхность электрода. Сила тока как скорость реакции может быть однозначно связана с концентрацией измеряемого компонента. Простейший случай в конструировании ферментного биосенсора реализуется при условии, что либо субстрат, либо продукт ферментативной реакции электрохимически активны, то есть способны быстро и желательно обратимо окисляться или восстанавливаться на электроде при наложении на него соответствующего потенциала.

Соответственно электрохимическая детекция процесса может быть организована путем регистрации тока восстановления кислорода или перекиси водорода. Оба случая реализованы на практике. В амперометрических биосенсорах поток электронов через поверхность датчика линейно связан с концентрацией анализируемого вещества в растворе. При адсорбции ферментов на твердых поверхностях (металлы, керамика, полимеры) они, как правило, сохраняют свою структуру и каталитическую активность. Фермент в режиме амперометрического биосенсора проявляет электрокаталитическую активность, то есть ускоряет процесс обмена электронами между субстратом и электродом. Электрокаталитический транспорт электронов может быть осуществлен несколькими принципиально различными путями (рис. 6).

1. Перенос электронов протекает с помощью диффузионно-подвижного промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов - медиатора. Медиатор должен быть достаточно специфическим субстратом фермента и быть электрохимически активным на электроде изданного материала. Медиаторный механизм транспорта электрона достаточно широко используется для проведения электрохимических ферментативных реакции.
2. Происходит прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента. Например, в атмосфере кислорода в присутствии медьсодержащей оксидазы - лакказы из Poluporos versocolor, сорбированной на электродах из различных материалов, устанавливается потенциал, близкий к термодинамически равновесному потенциалу кислорода. При этом имеет место стадия переноса электронов из электрода на активный центр фермента. Описано и электрокаталитическое восстановление пероксида водорода с помошью иммобилизованной пероксидазы, протекающее по такому же механизму.
3. При включении ферментов в органические полупроводники (органические металлы) можно наблюдать перенос электронов между активным центром фермента и доменами в полупроводнике. Все эти механизмы транспорта электронов активно используются при конструировании биосенсоров.

Если медиаторный перенос электрона - достаточно традиционный путь сопряжения электрохимической и ферментативной реакций, то прямой перенос, в котором фермент играет роль истинного электрокатализатора, представляет большой интерес. Остановимся на этом более подробно.

Впервые явление биоэлектрокатализа с участием прямого переноса электронов электрод- активный центр фермента было обнаружено и исследовано при изучении реакции электрохимического восстановления кислорода с участием медьсодержащей оксидазы - лакказы [5, 6]. В классической электрохимии электровосстановление кислорода - одна из наиболее сложных проблем. Известно, что равновесный потенциал окисления - восстановления пары О₂/Н₂О, равный 1,23 В, устанавливается лишь на предварительно специально обработанной платине и в особо чистых растворах. В то же время известны ферменты, которые активно восстанавливают кислород по четырехэлектронному механизму до воды без промежуточного образования в растворе пероксида водорода. Лакказа является медьсодержащим ферментом, осуществляют им четырехэлектронное восстановление кислорода при использовании в качестве донора различных ароматических аминов и фенолов. В активный центр фермента входят четыре иона меди, осуществляющие координированное восстановление кислорода.

Известно, что электровосстановление кислорода в нейтральных или слабокислых растворах на угольных материалах протекает со значительным перенапряжением. При введении в систему лакказы в незначительных количествах (10^{-9 М)} было замечено существенное смещение стационарного потенциала в область положительных значений и ускорение электровосстановления кислорода.

Наблюдаемые эффекты не зависят от природы электрода. Электрохимические измерения проводили на электродах из сажи, пирографита, стеклоуглерода или золота. Иммобилизацию лакказы осуществляли адсорбционным способом непосредственно на электрод. В присутствии кислорода и лакказы наблюдалось увеличение потенциала для всех исследуемыхв. Максимальное значение потенциала +1,207 B, близкое к равновесному потенциалу кислородного электрода, устанавликалось на электродах из сажи, которые предварительно были выдержаны в растворе лакказы (10^-5 М) в течение суток. Адсорбция фермента на электродах из сажи практически необратима. После иммобилизации электрод сохраняет каталитические свойства при отсутствии лакказы в растворе. Ферментативная природа электрокатализа была доказана специфическим ингибированием электрокатализа фторид- и азид-ионами, инактивацией фермента прогреванием, сопоставлением рН- зависимости электрокаталитических эффектов и каталитической активности к реакции окисления феррицианид-иона кислородом.

Таким образом, наблюдаемый электрохимический процесс на электроде с иммобилизованной лакказои определяется реакцией четырех электрон­ного восстановления кислорода до воды:

О₂ + 4е^- + 4Н⁺ → 2Н₂О.

Кислородные электроды на основе иммобилизованнои лакказы достаточно стабильны. Прямой электрокаталитический механизм переноса электронов обнаружен и исследован для лакказы, пероксидазы, гидрогеназы. При конструировании биосенсоров наибольшее применение нашел феномен электровосстановления перекиси водорода с помощью иммобилизованной пероксидазы. Приведем несколько примеров.

Определение ряда ключевых метаболитов

Многие ферменты осушествляют оксидазную реакцию с различными веществами (глюкоза, аминокислоты) с образованием перекиси водорода. В этом случае пероксидазный электрод используется для трансформации концентрационного сигнала в электрическую форму. В условиях, когда лимитирующей является первая стадия, величина тока линейно связана с концентрацией метаболита АН₂.

Определение супертоксинов и боевых отравляющих веществ

Большая группа фосфоорганических соединений выступает в роли сильных ядов, блокируя в центральной нервной системе фермент ацетилхолинэстеразу. По аналогичному механизму действуют большинство пестицидов. Были разработаны биосенсоры для детекции такого рода соединений с необходимой высокой чувствительностью. Ингибитор (зарин, зоман, V_х) блокирует активность ацетилхолинэстеразы, в конечном итоге уменьшая пероксидазный электрокаталитический ток через поверхность электрода. Чувствительность биосенсора доведена до 10^-12 М нейротоксина. Один из подходов к осуществлению переноса электронов между активным центром фермента и электродом заключается в использовании для иммобилизации ферментов матриц проводникового и полупроводникового характера.

Большой класс потенциальных носителей при создании биокатализаторов составляют органические полимерные полупроводники. Электропроводность полупроводниковых полимеров может изменяться в широком интервале (10^-5—10⁴Ом^-1 см^-1) и приближаться к электропроводности металлов. Для иммобилизации ферментов интерес представляют по крайней мере два класса органических полупроводников.

1. Полимеры с системой сопряженных связей, обладающие длинной цепью сопряжения. Они имеют сравнительно высокую электропроводность и представляют собой электронно-неоднородные системы, в которых области полисопряжений, характеризуемые "металлической" проводимостью, разделены диэлектрическими участками. Перенос электронов через диэлектрические участки определяет общий барьер транспорта электронов.

Термически обработанный полиакрилонитрил является достаточно хорошо изученным полимерным полупроводником. Электропроводность образцов зависит от температуры термической обработки. Носители были химически модифицированы окислением концентрированной азотной кислотой (введение нитро- и гидроксигрупп), обработкой гидразином и восстановлением с образованием аминогрупп. Иммобилизацию ферментов проводили на окисленных образцах термически обработанного полиакрилонитрила после гидрогенолиза и восстановления с использованием бифункционального реагента - глутарового альдегида. Интересно отметить, что между степенью окисления термически обработанного полиакрилонитрила и активностью иммобилизованного фермента существует определенная корреляция: емкость носителя до 100 мг белка на 1 г полимера. В последние годы широкое распространение получили органические полупроводники при электрохимической полимеризации ароматических соединений непосредственно на электроде (полипирол, полианилин, полимер метиленовый синий).

2. Полимеры с комплексами переноса заряда (КПЗ). Предельным вариантом сильных КПЗ являются ион-радикальные пары. В системах с КПЗ, так же как и в системах с полисопряжением, электропроводность обеспечивается за счет π-электронов, но делокализация их происходит к плоскостях, перпендикулярных плоскостям, упакованных в пачки молекул. Механизм проводимости обусловлен ион-радикальным диспропорционированием в пачках, состоящих из доноров и акцепторов электронов. Классическим примером проводников, действующих по ион-радикальному механизму, являются соли на основе тетрацианхинодиметана (TCNQ). Проводимость в таких системах обычно связывают с образованием КПЗ между молекулами TCNQ.

Способ получения таких иммобилизованных ферментов заключается в соосаждении поликатионов с ферментами под действием полувосстановленной соли TCNQ. Фермент иммобилизуется в водопроницаемые полимеры с высокой электропроводностью (вплоть до 10^-2 Ом^-1 см^-1). Емкость носителей - до 500 мг белка на 1 г носителя. Использование новых материалов органических полупроводников с включенными в них ферментами позволило создать новое поколение биосенсоров. В некоторых случаях электрохимические биосенсоры удобно реализовывать в форме потенциометрических ячеек с измерением смешения потенциала электрода, возникающего за счет электрохимической реакции. Калибровочная кривая в этом случае коррелирует смещение потенциала и логарифмическое значение концентрации аналита.

КЛЕТОЧНЫЕ БИОСЕНСОРЫ

Одно из достижений биотехнологии и биоинженерии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы и применением такого рода материалов для решения задач медицины, управляемого биосинтеза, анализа. С использованием живых иммобилизованных клеток создано много различных биосенсоров [7]. Можно отметить несколько удивительных свойств иммобилизованных клеток.

1. Клетки - доступный биологический материал. Используют клетки растений, животных, человека, но наибольшее применение нашли клетки микроорганизмов, которые культивируются, легко воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре. В отличие от ферментов при использовании клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки.
2. Имеющиеся методы иммобилизации позволяют получить клетки, сохраняющие около 100% активности ферментов и способные функционировать достаточно длительные промежутки времени. Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некоторых случаях клетки сохраняют жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет.
3. Клетки сохраняют, как правило, все системы жизнеобеспечения, включая ферментные стадии регенерации кофакторов. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.
4. Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических операций, дающие возможность получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать с высокоэффективными каталитическими системами. Поскольку клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка, потенциально могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики.

Особенности метаболизма клеток позволяют создавать биосенсоры как на индивидуальные молекулы, так и на очень широкие классы соединений, например на всю совокупность биологически поглошаемых веществ. Для создания клеточных биосенсоров, так же как и для ферментных, используются самые различные физические трансдьюсеры: электрохимические, включая амперометрические (детекторы кислорода, пероксида водорода, медиаторы), потенциометрические (рН-чувствительные и ионселективные электроды, рН-чувствительные полевые транзисторы), кондуктометрические, оптические, акустические, калориметрические. Развитие получили биосенсоры с использованием техники LAPS (светоадресуемых потенциометрических сенсоров). LAPS-система достаточно чувствительна, и на ее основе были созданы системы слежения за физиологическим состоянием отдельных клеток - так называемые микрофизиометры.

Принципиальным вопросом при создании клеточных биосенсоров является метод иммобилизации клеток. Первоначально для иммобилизации клеток с сохранением их активности использовали материалы природного происхождения: желатину, агар, альгинат кальция, каррагенан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели. Особенно интересные и перспективные результаты получены с использованием так называемого метода криоиммобилизации клеток [8]. Процедура иммобилизации состоит из стадии получения суспензии клеток в растворе полимера, замораживания суспензии с получением криоструктурированных гелей, размораживания с образованием пористого, механически прочного материала, устойчивого до температур 70-80°С. Клетки, включенные в такого рода пористый материал, сохраняют активность и способны функционировать в течение нескольких месяцев.

Применения клеточных биосенсоров достаточно многообразны. Созданы биосенсоры для селективного определения фенолов, пролина, глутамина, тирозина, молочной и аскорбиновой кислот, глюкозы. Интересные возможности связаны с анализом сульфат-иона, аммония, монометилсульфата. Уникальные возможности обеспечивают клеточные биосенсоры для экспресс-анализа качества коды и сточных код. Существует метод определения БПК (биологического потребления кислорода) - анализ на определение совокупности органических соединении, которые могут быть использованы микроорганизмами. Традиционный метод требует для получения данных несколько дней. Биосенсор с иммобилизованными клетками позволяет получать эти же результаты в течение нескольких минут. Коммерчески значимые прототипы биосенсоров для определения качестка коды созданы компаниями Японии, Германии и Бельгии.

Биосенсоры как новые аналитические устройства, позволяющие получать и перерабатывать экспресс-информацию о химическом составе тех или иных объектов, находятся к начале своего развития. Можно ожидать существенного вклада этих биоэлектронных устройств в повышение качества медицинских анализов, контроля технологических процессов, оценки качества пищевых продуктов и окружающей среды.

ЛИТЕРАТУРА

1. Журнал аналитической химии. 1991. Т. 45, № 7.
2. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с модифицированными и ультрамикроэлектродами. М.: Наука, 1994. 239с.
3. Seitz W.R. Fiber Optics Sensors // Anal. Chem. 1984. Vol. 86, № 1. P. 16 A.
4. Clark L.C., Lyons С // Ann N.Y. Acad. Sci. 1962. Vol. 102. P. 29-45.
5. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д. и др.// Докл. АН СССР. 1978. Т. 240. С. 615-619.
6. Варфоломеев С.Д., Березин И.В. В кн.: Физическая химия: Современные проблемы / Под ред. Я.М. Колотыркина. М.: Химия, 1982. С. 68-94.
7. Корпан Я.И., Ельская А.В. // Биохимия. 1995. Т. 60. С.1988-1998.
8. Lozinsky V.I. er al. // Biotechnol. Lett. 1984. Vol. 2, P. 43-48.