Нанотехнологическое сообщество Нанометр, все о нанотехнологиях
на первую страницу Новости Публикации Библиотека Галерея Сообщество Объявления Олимпиада ABC О проекте
 
  регистрация
помощь
 

Генная терапия, или как загнать ДНК в клетку и вылечить этим пациентов

Ключевые слова:  биоинженерия, биотехнология, генная терапия, ДНК, периодика

Автор(ы): Муртазин Азат Инзирович

Опубликовал(а):  Муртазин Азат Инзирович

31 января 2015

Введение

С каждым годом в научных журналах появляется всё больше статей о медицинских клинических исследованиях, в которых, так или иначе, применялось лечение, основанное на введении различных генов – генная терапия. Это направление выросло из таких хорошо развивающихся разделов биологии, как молекулярная генетика и биотехнология.

Зачастую, когда обычные (консервативные) методы уже перепробованы, именно генная терапия может помочь пациентам выжить и даже полностью выздороветь. Например, это касается наследственных моногенных заболеваний, то есть таких, которые вызваны дефектом в одном-единственном гене, а также и многих других [1]. Или, к примеру, генная терапия может выручить и спасти конечность тем больным, у которых сужен просвет сосудов в нижних конечностях и вследствие этого развилась стойкая ишемия окружающих тканей, то есть эти ткани испытывают сильный недостаток питательных веществ и кислорода, которые в норме разносятся кровью по организму [2]. Хирургическими манипуляциями и лекарствами таких пациентов лечить зачастую не получается, зато если локально заставить клетки выбрасывать наружу больше белковых факторов, которые повлияли бы на процесс образования и прорастания новых сосудов, то ишемия стала бы гораздо менее выраженной и жить больным станет гораздо легче.

Генную терапию сегодня можно определить как лечение заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты совсем недавно – 22 мая 1989 года в целях диагностики рака. Первым наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит [3].

С каждым годом число успешно проведенных клинических испытаний лечения различных заболеваний с использованием генной терапии растёт, и к январю 2014 г. достигло 2 тысяч [4].

Вместе с тем и в современных исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирования генами или «перетасованными» (рекомбинантными) ДНК in vivo (лат. буквально "в живом") изучены недостаточно. В странах с наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области, особенно в США, медицинские протоколы с использованием смысловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экспертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. В США таковыми являются Консультативный комитет по рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory Committee, RAC) и Управление по лекарствам и пищевым продуктам (Food and Drug Administration, FDA) с последующим обязательным утверждением проекта директором Национальных институтов здоровья (National Institutes of Health) [3].

Итак, мы определились, что данное лечение основано на том, что если какие-то ткани организма испытывают недостаток некоторых отдельных белковых факторов, то это можно исправить введением в эти ткани соответствующих генов, кодирующих белки, и всё станет более или менее замечательно. Сами белки вводить не получится, потому что наш организм тут же среагирует неслабой иммунной реакцией, да и длительность действия была бы недостаточной. Теперь следует определиться с методом доставки гена в клетки.

Трансфекция клеток

Для начала стоит ввести определения некоторых терминов.

Транспорт генов осуществляется благодаря вектору – это молекула ДНК, используемая как «транспортное средство» для искусственного переноса генетической информации в клетку. Выделяют множество разновидностей векторов: плазмидные, вирусные, а также космиды, фазмиды, искусственные хромосомы и т.д. Принципиально важно, что векторы (в частности, плазмидные) обладают характерными для них свойствами:

1. Точка начала репликации (ori) – последовательность нуклеотидов, с которой начинается удвоение ДНК. Если векторная ДНК не сможет удваиваться (реплицироваться), то необходимый лечебный эффект не будет достигнут, потому что она просто быстро расщепится внутриклеточными ферментами-нуклеазами, а из-за недостатка матриц будет в итоге образовано гораздо меньше молекул белка. Следует отметить, что эти точки специфичны для каждого биологического вида, то есть если векторную ДНК предполагается получать путём её размножения в культуре бактерий (а не просто химическим синтезом, что обычно гораздо дороже), то потребуются отдельно две точки начала репликации – для человека и для бактерий;

2. Сайты рестрикции – специфические короткие последовательности (чаще палиндромные), которые узнаются специальными ферментами (эндонуклеазы рестрикции) и разрезаются ими определённым образом – с образованием «липких концов» (рис.1).

Рис.1 Образование "липких концов" с участием рестриктаз

Эти сайты необходимы для того, чтобы сшить векторную ДНК (которая, по сути, является «болванкой») с нужными терапевтическими генами в единую молекулу. Такая сшитая из двух или нескольких частей молекула зовётся «рекомбинантной»;

3. Понятно, что нам желательно бы получить миллионы копий рекомбинантной молекулы ДНК. Опять-таки, если мы имеем дело с культурой клеток бактерий, то далее эту ДНК нужно выделить. Проблема заключается в том, что далеко не все бактерии проглотят нужную нам молекулу, некоторые не станут этого делать. Чтобы эти две группы всё-таки различить, в векторную ДНК вставляют селективные маркёры – участки устойчивости к определённым химическим веществам; теперь если в среду добавить эти самые вещества, то выживут только те, которые обладают устойчивостью к ним, а остальные погибнут.

Все эти три составляющие можно наблюдать и в самой первой искусственно синтезированной плазмиде (рис.2).

Рис.2

Сам процесс внедрения плазмидного вектора в определённые клетки называется трансфекцией. Плазмида – это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая находится в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут выбрасываться бактерией в окружающую среду или, наоборот, поглощаться (процесс поглощения – трансформация). С помощью плазмид бактерии могут обмениваться генетической информацией, например, передавать устойчивость к определённым антибиотикам.

Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее ген-вставку и внедрить в клетку. В одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки [5].

Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней:

1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введённый материал попадёт во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению). В нашей стране она фактически запрещена [6];

2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных (размноженных) и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в определённые ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак легких).

Разработке программы генной терапии предшествует много этапов. Это и тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена (т. е., синтеза на матрице гена какого-то белка в определённой ткани), и идентификация первичного биохимического дефекта, и исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Важно, что при составлении схем коррекции генов оценивается эффективность трансфекции, степень исправления первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro, "в пробирке") и, что особенно важно, in vivo на животных – биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний [7].

Прямая доставка и клеточные носители терапевтических генов

Существует множество методов внедрения чужеродной ДНК в эукариотическую клетку: некоторые зависят от физической обработки (электропорация, магнетофекция и т.д.), другие – от применения химических материалов или биологических частиц (например, вирусов), которые используются как переносчики. Сразу стоит оговориться, что обычно комбинируются химические и физические методы (например, электропорация + окутывание ДНК липосомами)

Прямые методы

1. Трансфекция на химической основе может быть классифицирована на несколько видов: с использованием вещества циклодекстрина, полимеров, липосом или наночастиц (с или без химической или вирусной функционализации, т.е. модификации поверхности).
а) Один из самых дешевых методов – использование фосфата кальция. Он повышает эффективность включения ДНК в клетки в 10-100 раз. ДНК образует с кальцием прочный комплекс, что обеспечивает его эффективное поглощение. Недостаток – ядра достигает всего около 1 – 10% ДНК. Метод используется in vitro для переноса ДНК в клетки человека (рис.3);

Рис.3

б) Применение сильноразветвленных органических молекул – дендример, для связывания ДНК и переноса её в клетку (рис.4);

Рис.4

в) Очень эффективным методом для трансфекции ДНК является внедрение её через липосомы – малые, окруженные мембраной тельца, которые могут сливаться с клеточной цитоплазматической мембраной (ЦПМ), представляющая собой двойной слой из липидов. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo (рис.5);

Рис.5

г) Еще один метод – использование катионных полимеров, таких как диэтиламиноэтил–декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженные молекулы ДНК связываются с положительно заряженными поликатионами, и этот комплекс далее проникает в клетку путём эндоцитоза. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует поглощение этого комплекса клеткой. Главный недостаток метода заключается в том, что ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен. Метод не получил распространения в генотерапии;

д) С помощью гистонов и других ядерных белков [8]. Эти белки, содержащие много положительно заряженных аминокислот (Lys, Arg), в естественных условиях помогают компактно уложить длинную цепь ДНК в сравнительно небольшое ядро клетки.

2. Физические методы:

а) Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля. Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется (рис.6).

Рис.6

б) «Cell squeezing» – метод, изобретенный в 2013 г. Он позволяет доставить молекулы в клетки путём "мягкого сдавливания" клеточной мембраны. Метод исключает возможность токсичности или неправильного попадания по мишени, так как он не зависит от внешних материалов или электрических полей;

в) Сонопорация – метод искусственного переноса чужеродных ДНК в клетки с помощью воздействия на них ультразвуком, вызывающим открывание пор в клеточной мембране;
г) Оптическая трансфекция – метод, при котором производится крошечное отверстие в мембране (около 1 мкм в диаметре) при использовании сильносфокусированного лазера;
д) Гидродинамическая трансфекция – метод доставки генетических конструкций, белков и т.д. путем контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. Осуществляется быстрой инъекцией в ткань, доставка при этом является неспецифичной. Эффективность доставки для скелетной мышцы – от 22 до 60% [9];

е) Микроинъекция ДНК – введение в ядро клетки животных с помощью тонких стеклянных микротрубочек (d=0,1-0,5 мкм). Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК; можно трансформировать ограниченное число клеток. Не используется для человека.

3. Методы на основе частиц.

а) Прямой подход к трансфекции – генная пушка, при этом ДНК сцепляют в наночастицу с инертными твердыми веществами (чаще золото, вольфрам), которая затем «выстреливает» направленно в ядра клеток-мишеней. Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов, в частности, в клетки мышечных тканей, например при таком заболевании, как миодистрофия Дюшена. Размеры частиц золота – 1-3 мкм (рис.7).

Рис.7

б) Магнитофекция - метод, использующий силы магнетизма для доставки ДНК в клетки-мишени. Сначала нуклеиновые кислоты (НК) ассоциируются с магнитными наночастицами, а далее, под действием магнитного поля, частицы загоняются в клетку. Эффективность почти 100%-ная, отмечена явная нетоксичность. Уже через 10-15 мин частицы регистрируются в клетке – это гораздо быстрее других методик.
в) Импалефекция (impalefection; "impalement", букв. "сажание на кол" + "infection") – метод доставки с применением наноматериалов, таких как углеродные нанотрубки и нановолокна. При этом клетки буквально протыкаются подстилкой из нанофибрилл [10]. Приставка «нано» применяется для обозначения их очень маленьких размеров (в пределах миллиардных долей метра) (рис.8).

Рис.8

Отдельно стоит выделить такой метод, как РНК-трансфекция: в клетку доставляется не ДНК, а молекулы РНК – их «преёмники» в цепи биосинтеза белка; при этом активизируются специальные белки, разрезающие РНК на короткие фрагменты -- т.н. малые интерферирующих РНК (миРНК). Эти фрагменты связываются с другими белками и, в конце концов, это приводит к угнетению экспрессии клеткой соответствующих генов. Таким образом можно заблокировать в клетке действие тех генов, которые потенциально на данный момент приносят больше вреда, чем пользы. Широкое применение РНК-трансфекция нашла, в частности, в онкологии.

Основные принципы доставки генов с использованием плазмидных векторов рассмотрены. Теперь можно перейти к рассмотрению вирусных методов. Вирусы – это неклеточные формы жизни, чаще всего представляющие собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), обёрнутой в белковую оболочку. Если вырезать из генетического материала вируса все те последовательности, которые вызывают возникновение заболеваний, то весь вирус также можно успешно превратить в «транспортное средство» для нашего гена.

Процесс внедрения ДНК в клетку, опосредованное вирусом, называется трансдукцией.
На практике чаще всего используют ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Для начала стоит разобраться, каким должен быть идеальный кандидат для трансдукции среди вирусов. Критерии таковы, что он должен быть:

• стабилен;
• ёмок, то есть вмещать достаточное количество ДНК;
• инертным в отношении метаболических путей клетки;
• точным – в идеале, должен встраивать свой геном в конкретный локус генома ядра хозяина и др.

В реальной жизни очень сложно скомбинировать хотя бы несколько пунктов, так что обычно выбор происходит при рассмотрении каждого индивидуального случая в отдельности (рис.9).

Рис.9

Из всех трёх перечисленных наиболее используемых вирусов самыми безопасными и одновременно самыми точными являются AAV. Их почти что единственный недостаток – сравнительно малая ёмкость (ок. 4800 п.н.), которая, однако, оказывается достаточной для многих генов [5].

Помимо перечисленных методов достаточно часто генная терапия применяется в комбинации с клеточной: при этом сначала в питательную среду высаживают культуру определённых клеток человека, после этого тем или иным способом внедряют в клетки нужные гены, некоторое время культивируют и снова пересаживают в организм хозяина. В результате клеткам можно вернуть их нормальные свойства. Так, к примеру, модифицировали белые клетки крови человека (лейкоциты) при лейкемии (рис.10).

Рис.10

Судьба гена после его попадания в клетку

Так как с вирусными векторами всё более-менее ясно в силу их свойства более эффективно доставлять гены до конечной цели – ядра, то остановимся на судьбе плазмидного вектора.

На данном этапе мы добились того, что ДНК прошла первый большой барьер – цитоплазматическую мембрану клетки.

Далее, в комплексе с другими веществами, оболочкой или без, ей необходимо достигнуть клеточного ядра, чтобы специальный фермент – РНК-полимераза – синтезировала молекулу информационной РНК (иРНК) на матрице ДНК (этот процесс называется транскрипция). Только после этого иРНК выйдет в цитоплазму, образует комплекс с рибосомами и согласно генетическому коду синтезируется полипептид – например, фактор роста сосудов (VEGF), который начнёт выполнять определённую терапевтическую функцию (в данном случае – запустит процесс образования ветвлений сосудов в ткани, подверженной ишемии).

Что касается экспрессии введенных генов в требуемом типе клеток, то эта задача решается с помощью регуляторных элементов транскрипции. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией специфичного для этой ткани энхансера («усиливающей» последовательности) с определенным промотором (последовательность нуклеотидов, с которой РНК-полимераза начинает синтез), который может быть индуцируемым [11, 12]. Известно, что активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, а так как энхансеры могут работать с любым геном, то в вектора можно вводить еще инсуляторы, которые помогают энхансеру работать независимо от его положения и могут вести себя как функциональные барьеры между генами. Каждый энхансер содержит набор участков связывания активирующих или супрессирующих белковых факторов [11]. С помощью промоторов можно также регулировать уровень экспрессии генов. Например, есть металлотионеиновые или температурочувствительные промоторы; промоторы, управляемые гормонами.

Экспрессия гена зависит от его положения в геноме. В большинстве случаев существующие вирусные методы приводят лишь к случайному встраиванию гена в геном. Чтобы исключить такую зависимость, при конструировании векторов снабжают ген известными нуклеотидными последовательностями, которые позволяют гену экспрессироваться независимо от места его встраивания в геном.

Наиболее простой путь регуляции экспрессии трансгена – это обеспечение его индикаторным промотором, который чувствителен к физиологическому сигналу, такому, как выделение глюкозы или гипоксия. Такие «эндогенные» контролирующие системы могут быть полезны в некоторых ситуациях, таких, как осуществление глюкозозависимого контроля продукции инсулина. Более надежны и универсальны «экзогенные» системы контроля, когда экспрессия гена контролируется фармакологически введением маленькой лекарственной молекулы. В настоящее время известны 4 основные системы контроля - регулируемые тетрациклином (Tet), стероидом насекомых, экдизоном или его аналогами, антипрогестиновым препаратом майфпристоном (RU486) и химическими димеризаторами, такими, как рапамицин и его аналоги. Все они включают лекарственно зависимое привлечение домена активации транскрипции к основному промотору, ведущему нужный ген, но отличаются по механизмам этого привлечения [13].

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства [14,15]. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека [16].

Прикрепленные файлы:
 

В статье использованы материалы: Нанометр




Для того чтобы оставить комментарий или оценить данную публикацию Вам необходимо войти на сайт под своим логином и паролем. Зарегистрироваться можно здесь

 

Шарики в бороздках
Шарики в бороздках

4 февраля объявили лауреатов V Всероссийской премии «За верность науке»
4 февраля в здании Минобрнауки РФ состоялась торжественное награждение лауреатов V Всероссийской премии «За верность науке». 11 научно-просветительских проектов были отмечены престижной наградой.

Всероссийский съезд учителей и преподавателей химии
5 февраля в Московском университете в Шуваловском корпусе МГУ состоится Всероссийский съезд учителей и преподавателей химии, посвященный Международному году Периодической таблицы химических элементов, начало - 10 часов.

II Всероссийский химический диктант пройдет 18 мая 2019 года
В 2019 году периодическому закону Дмитрия Менделеева исполнится 150 лет! В честь великого открытия этот год объявлен Международным годом Периодической таблицы химических элементов. Одним из наиболее ярких событий, приуроченных к этому году, станет II Всероссийский химический диктант, который пройдет 18 мая и который в этом году выходит на международный уровень. Мероприятие было анонсировано в рамках церемонии открытия Международного года Периодической таблицы химических элементов 29 января 2019 года в Париже, в штаб-квартире ЮНЕСКО.

Самые необычные таблицы Менделеева на выставке Международного года Периодической таблицы химических элементов

6-8 февраля в Российской академии наук состоялось торжественное открытие Международного года периодической таблицы химических элементов в России и приуроченная к этому масштабная интерактивная выставка

Почувствовать живое...
Е.А.Гудилин, А.А.Семенова, Н.А.Браже
Неразрушающее исследование живых клеток и клеточных структур является в настоящее время важным направлением научных изысканий, которые во многих зарубежных и российских научных группах направлены на достижение вполне прагматической цели – разработку новых принципов биомедицинской диагностики и эффективных подходов в нарождающейся персональной медицине.

Российская газета: Перевернуть пирамиду. Президент РАН: как повысить наши шансы на Нобеля
Юрий Медведев
Почему Россия по числу Нобелей отстает от ведущих стран мира, уступая, например, даже маленькой Швейцарии? Замалчиваются ли достижения отечественных ученых? Почему без привлечения в науку российского бизнеса мы не сможем успешно конкурировать в борьбе за престижную научную премию? Об этом корреспондент "РГ" беседует с президентом РАН Александром Сергеевым, который побывал в Стокгольме на вручении Нобелевских премий и поделился своими впечатлениями.

Инновационные системы: достижения и проблемы
Олег Фиговский, Валерий Гумаров

Технопредпринимательство на марше

Мы традиционно просим вас высказать свои краткие суждения по вопросу технопредпринимательства и проектной деятельности школьников. Для нас очевидно, что под технопредпринимательством и под проектной деятельностью школьников каждый понимает свое, но нам интересно ваше мнение, заодно вы сможете увидеть по мере прохождения опроса, насколько оно совпадает или отличается от мнения остальных. Ждем ваших ответов!

О наноолимпиаде замолвите слово...

Прошла XII Всероссийская олимпиада "Нанотехнологии - прорыв в Будущее!" Мы надеемся, что нам для улучшения организации последующих наноолимпиад поможет электронное анкетирование. Мы ждем Ваших замечаний, пожеланий, предложений. Спасибо заранее!

Опыт обучения в области нанотехнологического технопредпринимательства

В этом опросе мы просим поделиться опытом и Вашим отношением к нанотехнологическому технопредпринимательству и смежным областям. Заранее спасибо за Ваше неравнодушие!



 
Сайт создан в 2006 году совместными усилиями группы сотрудников и выпускников ФНМ МГУ.
Сайт модернизирован для ресурсной поддержки проектной деятельности учащихся в рамках ГК 16.647.12.2059 (МОН РФ)
Частичное или полное копирование материалов сайта возможно. Но прежде чем это делать ознакомьтесь с инструкцией.