Известно, что методическими ограничениями спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) в клеточной биологии, биофизике и биохимии являются низкие концентрации исследуемых молекул и/или клеток, а также возможное повреждающее действие лазера на объект. Таким образом, важной задачей становится использование методов, позволяющих исследовать свойства молекул, изолированных или находящихся в клетках, при низких концентрациях и неповреждающих мощностях лазеров. Для усиления комбинационного рассеяния от отдельных молекул и молекул в составе клеток используется такой подход, как
спектроскопия гигантского, или поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (ГКР) - surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). ГКР наблюдается при взаимодействии света с наноразмерными частицами (НЧ) благородных металлов, главным образом, серебра и золота.
Вы задумали использовать ГКР в биологическом эксперименте.

А. Вы получили коллоидный раствор наночастиц серебра или золота. Непосредственное добавление коллоидного раствора к клеткам или раствору исследуемых ферментов приведет к существенному изменению ионного состава среды и как следствие, вызовет изменение
функционального состояния клеток и ферментов. Как можно избежать негативного действия коллоидного раствора на исследуемый объект при сохранении усиления сигнала КР (5 баллов)?

Б. Ваш объект - культура клеток, обладающих активным эндоцитозом. Ваша задача: на живых интактных клетках с применением наночастиц оценить изменение pH в эндосомных пузырьках в процессе эндоцитоза. Как модифицировать НЧ, чтобы они стали рН-сенсорами? Детально опишите постановку, условия и ход эксперимента, а также трактовку полученных результатов (5 баллов). Какие сложности могут возникнуть при анализе спектров КР (2 балла)? Как определить, что при исследовании клетки остались живыми и их свойства не изменились (2 балла)?

С. Какие еще НЧ-биосенсоры можно сделать? Каким требованиям должны удовлетворять эти НЧ (3 балла)?

Ответ: Основное, что следует помнить – надо выбирать такой способ синтеза НЧ, чтобы в получившемся коллоидном растворе не содержалось веществ, токсических для клеток. В противном случае после синтеза коллоидного раствора надо проводить его очистку от этих веществ. Для того, чтобы уменьшить действие коллоидного раствора на клетки можно сконцентрировать НЧ в полученном коллоидном растворе. Один из простых вариантов – осаждение НЧ центрифугированием. В этом случае к клеткам будет добавляться меньший объем коллоидного раствора. Если клетки достаточно устойчивы к перепаду осмолярностей, то перед внесением коллоидного раствора НЧ к клеткам можно добавить физиологический раствор с повышенным содержанием солей, чтобы после добавления коллоидного раствора среда с клетками имела нормальную осмолярность.

НЧ-рН-сенсоры, это НЧ, поверхность которых покрыта веществом, спектр КР которого изменяется в широком диапазоне рН. В данном случае наночастица нужна как носитель молекулы-зонда на pH и для усиления сигнала КР от молекулы-зонда. В качестве молекулы, спектр КР которой зависит от pH в широком диапазоне, можно использовать меркаптобензойную кислоту или аминобензентиол. Сначала надо снять калибровку – зависимость спектров ГКР полученного рН-биосенсора от значения рН в растворе. Так как клетки обладают эндоцитозом, то НЧ-рН-биосенсоры будут захватываться клетками при совместной инкубации. После этого от участков клетки с НЧ регистрируют спектры ГКР. В течение эндоцитоза рН внутри эндосомы будет уменьшаться и это будет отражаться на спектрах ГКР НЧ-биосенсора. Затем по калибровке определяется значение pH. Сложности в анализе экспериментальных данных: сильное изменение базовой линии в спектрах ГКР НЧ-биосенсора, а также появление новых полос в спектре, связанных с усилением КР от клеточных компонентов.

Для того, чтобы проверить состояние клеток, надо провести один или несколько функциональных тестов до использования НЧ и после эксперимента и сопоставить полученные данные с результатами для клеток, к которым НЧ не добавляли. Например, можно оценить функциональное состояние митохондрий, форму ядра и т.д. Если клетки прикрепляются к субстрату, то оценить, изменилось ли количество прикрепленных клеток по сравнению с контролем.

В качестве наночастиц-биосенсоров, например, можно сделать: (1) биосенсоры на глюкозу (работы Van Duyne с коллегами), (2) на кислород-анион-радикал (покрыть НЧ монослоем молекул с двойными или споряженными связями, активно реагирующими с О₂^-, спектр КР которых чувствителен к состоянию двойных связей, в т.ч. к присоединению О₂^-), (3) на ионы Са²⁺. Если НЧ-биосенсор готовится для исследования цитоплазматических процессов, то надо учесть необходимость механизма выхода НЧ из эндосомы в цитоплазму. Требования к биосенсорам: стабильность внутри клетки и в физиологическом растворе, нетоксичность.

Вторая часть вопроса подразумевает творческий подход и самостоятельные рассуждения участника.