Одно из важных и актуальных направлений биологии - визуализация живых клеток и поверхностных и подмембранных структур живых клеток с субмикрометровым разрешением. Один из методов, позволяющих подобные исследования - это атомно-силовая микроскопия (АСМ).

Укажите:

А. Особенности клеток, которые следует учесть при работе с АСМ (1 балл)?

Б. Какие моды АСМ Вы бы предложили применить при работе с живыми клетками (1 балл)?

В. Какие типы клеток не могут быть исследованы при помощи АСМ в “живом” виде (1 балл)?

Г. Какие клеточные структуры могут быть визуализованы с использованием АСМ на живых клетках (1 балл)?

Д. Какие возможные артефакты следует учесть при использовании АСМ для визуализации клеток и их структур? Как можно проверить, является ли некоторый подозрительный участок АСМ изображения клетки особенностью клетки или артефактом сканирования (2 балла)?

Е. Какой вариант сканирующей зондовой микроскопии Вы можете предложить для визуализации живых клеток с субмикрометровым разрешением в альтернативу АСМ (2 балла)?

Ответ:

А. Многие типы клеток – мягкие, изменяющие свои свойства, в частности, морфологию, при оказании локального давления зонда кантиллевера. Кроме того, в некоторых клетках, например, нейронах с механочувствительными рецепторами при давлении зонда будут изменяться мембранные и цитоплазматические процессы (активность ионных каналов и транспорт ионов через мембрану, перестройки цитоскелета и проч.). Другая особенность – разная способность клеток в прикреплению к подложке. Клетки, которые по своей натуре не прикрепляются или слабо иммобилизуются на подложках при сканировании будут отрываться и переходить в раствор.

Б. В зависимости от типа клеток – полуконтактная мода с низкой амплитудой раскачивания кантиллевера, с мягким кантиллевером и слабой степенью прижатия зонда к клетке (для уменьшения давления на клетку), бесконтактная мода, прыгающая мода (jumping-mode). Возможна работа с мягкими кантиллеверами в контактной моде при слабой степени прижатия зонда к клетке. Кроме того, для мягких клеток, которые повреждаются зондом, можно снимать не полностью все изображение, а регистрировать кривые отрыва зонда.

В. В “живом” виде не могут быть исследованы очень мягкие и легко повреждающиеся клетки, как, например, дендритные клетки иммунной системы и некоторые типы нейронов; механочувствительные клетки, которые будут значительно изменять свои свойства при сканировании, например, механочувствительные нейроны или тучные клетки, в которых при сканировании будет активироваться экзоцитоз; клетки, которые в организме существуют в неприкрепленном состоянии (эритроциты, лимфоциты и др.). Все перечисленные типы клеток могут быть исследованы методом АСМ только при фиксации специальными агентами (глутаровым альдегидом, метанолом и проч.)

Г. Любые поверхностные структуры (ворсинки и любые выросты), если они достаточно жесткие и не будут втягиваться или повреждаться при сканировании. Кроме того, на относительно жестких клетках, таких как макрофаги или фибробласты, можно исследовать подмембранный цитоскелет, усиливая степень прижатия зонда к клетке и, таким образом, проминая клетку в местах, где нет цитоскелета.

Д. Изменение формы клетки при давлении зонда, маленькие или большие смещения клетки из-за движения зонда (зонд “тянет” за собой клетку), повреждение клетки зондом и вытекание цитоплазмы. Получаемое изображение может зависеть не только от морфологии клетки, но и от локальных вязкости и упругости клетки, силы трения и т.д. При сканировании на зонд могут “налипать” белки или кусочки ткани, что тоже будет влияеть на изображение. Повреждение зонда, например, трещинка или скол кончика могут приводить к появлению нетипичных повторяющихся структур на всей области сканирования. Способы проверки артефактов: сканирование клетки в одном направлении, потом – в другом; уменьшение скорости сканирования, замена кантиллевера, смена моды сканирования или изменение степени прижатия зонда к сканируемой поверхности или амплитуды раскачивания зонда (в полуконтакной моде).

Е. Возможной альтернативой АСМ для визуализации клетки является сканирующая микроскопия ионной проводимости (англ. Scanning ion conductance microscopy), в которой вместо кантиллевера используется стекляный микроэлектрод, заполненный буферным раствором. При приближении кончика электрода к клетке уменьшается ток ионов через кончик электрода (из-за стерических препятствий) и по падению силы тока восстанавливается геометрия поверхности.