Успешное лечение заболеваний во многом зависит от того, на какой стадии патология была выявлена. Таким образом, развитие методов, позволяющих диагностировать патологии на ранних стадиях развития, является очень актуальной задачей медицины, биологии и нанотехнологий. Не менее важное направление био-медицинских исследований – это разработка методов, позволяющих в ходе хирургической операции по удалению злокачественных или поврежденных клеток, различать здоровые и больные клетки.

Какие спектро-и микроскопические методы исследования и какие наноматериалы Вы бы предложили использовать:

А. Для увеличения чувствительности методов, выявляющих антитела или патологические/неспецифические белки в плазме крови или тканях, взятых биопсией (2 балла).

Б. Для чувствительного обнаружения патологических клеток в образце ткани, взятом при помощи биопсии или в клеточной культуре (2 балла)? Как Вы считаете, в каких именно свойствах клеток на ранних стадиях патологии следует искать отличия от здоровых клеток того же типа (2 балл)?

В. Для дискриминации нормальных и патологических клеток в органе при проведении операции по удалению поврежденных или раковых клеток (4 балла)?

Ответ: Методами, позволяющими регистрировать наличие определенных молекул в исследуемом образце в субмикромолярных концентрациях, являются спектроскопия и микро-спектроскопия локального поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР) (Local Surface Plasmon Resonance spectroscopy, LSPRS) и спектроскопия и микро-спектроскопия гигантского (или поверхностно-усиленного) комбинационного рассеяния (ГКР) (Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS). Оба метода основаны на использовании эффекта плазмонного резонанса, существующего на поверхности наночастиц (НЧ) или наноструктур (НС) тонких подложек, сделанных из благородных металлов (обычно используют золото или серебро).

Спектроскопия ЛППР основана на регистрации изменений спектров поглощения, пропускания или отражения серебряных или золотых наночастиц или наноструктур подложек при сорбции на них молекул. Сорбция любых молекул на поверхность НЧ Ag, Au или НС Ag, Au приводит к изменению локального показателя преломления на поверхности НЧ или НС, в результате чего изменяется локальное электро-магнитное поле и сдвигается максимум поглощения (пропускания или отражения, в данном случае, что более удобно регистрировать) в спектре поглощения (пропускания или отражения) НЧ Ag, Au или НС Ag, Au. Для того, чтобы получить селективность во взаимодействии НЧ и НС с теми молекулами, которые надо обнаружить в образце, необходимо модифицировать поверхности НЧ и НС веществами, избирательно связывающими исследуемые молекулы.

В спектроскопии ГКР исследуемая молекула должны быть сорбирована на поверхности НЧ Ag, Au или НС Ag, Au, в результате чего за счет плазмонного резонанса происходит многократное усиление падающего излучения и комбинационного рассеяния молекулы. Поскольку спектр КР уникален для каждой молекулы, то при правильно подобранных условиях по спектрам поверхностно-усиленного КР можно установить, какие молекулы находятся в образце даже при их субмикромолярных концентрациях.

Ответ на пункт А: Основная идея – использовать спектроскопии ЛППР или ГКР с наночастицами или наноструктурными поверхностями из серебра или золота. В случае ЛППР поверхности НЧ и НС должны быть модифицированы для селективного связывания антитела и пр.

Поверхность колонки, через которую пропускают образец плазмы крови или экстракт из тканей, взятых биопсией, можно покрыть наночастицами Ag или Au, которые на себе будут нести антитела к тем антителам или другим белкам, которые нужно обнаружить. До и после пропускания через колонку исследуемого образца регистрируют спектры отражения и определяют сдвиг положения максимума плазмонного резонанса. Другой вариант – использовать подложки с наноструктурами из золота или серебра с пришитыми антителами к белку, который надо обнаружить.

Другой возможный вариант – это использовать спектроскопию ГКР: на подложку с наноструктурами Ag или Au, помещенными, например, в чашку Петри, нанести плазму крови или экстракт из ткани. Спектр ГКР будет соответствовать колебаниям связей в молекулах, присутствующих в пробе. Необходимо заранее иметь “стандарты” - набор спектров ГКР, которые присущи “здоровым” пробам – и по ним сравнивать спектры исследуемого образца. При правильно подобранных условиях эксперимента при наличии в образце нового антитела или неспецифического/патологического белка в спектре ГКР будут появляться новые полосы. Преимущество спектроскопии ГКР перед спектроскопией ЛППР в данном случае является отсутствие необходимости модифицировать поверхность наночастиц или наноструктур подложки, а недостатком – более сложный анализ данных.

Ответ на пункт Б: При канцерогенезе на ранних стадиях патологий будут изменяться интенсивность синтеза белка и пролиферативная активность клеток, а также будет изменяться белково-липидный состав мембран, в первую очередь, плазматической мембраны. Изменение структуры, состава и физико-химических свойств плазматической мембраны и ее подмембранных областей наблюдаются и при других патологиях клеток. Кроме того, при большинстве патологий происходит изменение функционального состояния и (иногда) морфологии митохондрий. Следовательно, надо подбирать методы, которые чувствительно и, желательно, неинвазивно, могут оценивать перечисленные свойства клеток.

Например, для того, чтобы обнаружить изменение белкового состава плазматической мембраны клеток, можно использовать спектроскопию ГКР. Клетки помещаются на подложки с серебрянными или золотыми наноструктурами и, вследствие плазмонного резонанса, усиление сигнала КР будет идти от молекул плазматической мембраны и тонкой подмембранной области. Спектр ГКР патологических клеток с другим составом белков в плазматической мембране будет отличаться от спектра ГКР здоровых клеток. Для дискриминации здоровых и больных клеток может использоваться традиционная микро-спектроскопия КР, позволящая получать КР-изображения клеток – спектры КР в каждой точке клетки. Поскольку белковый синтез в патологических клетках будет изменен, то и общий вид их спектров КР будет отличаться от спектров нормальных клеток.

Ответ на пункт В: Поскольку дискриминация клеток ведется во время хирургической операции, необходимо, чтобы предложенный метод был: (1) неинвазивным и не повреждал клетки и (2) быстрым и при этом эффективным. Возможный вариант – создание специальных оптических зондов с маленьким диаметром, чтобы в реальном времени зонд можно было подвести к опрерируемому участку органа и “просканировать” его – получить спектры клеток и по имеющимся спектрам-стандартам отличить здоровые клетки от больных (раковых или др.патологических). Вариантами таких зондов могут быть: ЯМР(ядерно-магнитный резонансный)-зонд, регистрирующий спектры ЯМР клеток и зонд с гигантским КР на кончике (англ. tip-enhanced Raman). Во втором случае (зонд с гигантским КР на кончике) поднесение зонда на расстояние 20-30 нм от поверхности клеток будет происходить многократное усиление сигнала КР от молекул клеточных поверхностей и по сравнению спектров-стандартов для здоровых клеток можно будет отличить здоровые клетки от больных.

Отметим, что ЯМР-зонд уже используется в одном из клинических госпиталей во Франции.