Поддержание нормальной жизнедеятельности клеток во многом зависит от структуры цитоскелета и функционирования моторных белков, отвечающих за транспорт органоидов по микротрубочкам. Какие спектральные и микроскопические методы и какие наноматериалы можно использовать для исследования свойств различных элементов цитоскелета и для изучения движения моторных белков (4 балла)? Для решения каких исследовательских задач Вы бы использовали предложенные Вами подходы (1 балл)?

Углеродные нанотрубки обладают рядом интересных свойств. В том числе: характерные полосы спектров КР нанотрубок характеризуют их диаметр и наличие дефектов структуры; нанотрубки имеют выраженное двойное лучепреломление, поглощение и испускание ими света также хорошо ориентировано. Как эти свойства можно использовать для исследования клеток и клеточных культур и каким образом (5 баллов)?

Ответ: Самый простой вариант – для визуализации разных элементов цитоскелета при помощи селективных флуоресцентных зондов или неспецифических флуоресцентных зондов, связанных с антителами к соответствующему элементу цитоскелета. Для длительных исследований перестроек цитоскелета следует использовать квантовые точки, меченные антителами к нужным элементам цитоскелета. Преимущество квантовых точек заключается в их меньшей токсичности для клеток по сравнению с флуоресцентными зондами, а также более стабильная флуоресценция во времени.

Аналогичный подход можно использовать для исследования движения моторных белков, например, кинезина или динеина по микротрубочкам. Квантовая точка метится антителом к моторному белку, а затем при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии исследуется перемещение квантовой точки (моторного белка) в клетке. Так же можно пометить нужный органоид в клетке, например, экзоцитозную везикулу и следить за его перемещением по клетке.

Относительно новый метод для исследования перемещений моторных белков – лазерный пинцет. Динеин или кинезин метится золотой наночастицей, а затем на ней фокусируют несколько инфракрасный лазер. По силе, которую надо приложить для того, чтобы золотая НЧ оставалась неподвижной, можно судить о силе, которую прикладывает моторный белок для перемещения по нанотрубочке. Лазерный пинцет также используют для деформации цитоскелета и исследования влияния структуры цитоскелета на морфологию клеток и клеточные процессы.

Для ответа на часть задачи по углеродным нанотрубкам следует учесть, что:

→ Механические деформации и химическая модификация нанотрубок при взаимодействии с цитоскелетом и др. белками клетки будут хорошо видны на спектрах КР. Отсюда – возможность визуализировать напряжения и силы, возникающие в архитектуре цитоскелета, вхождение попадание белков внутрь трубок и т.п.

→ Используя методы интерференционной, флуоресцентной и КР-микроскопии позволит визуализировать упорядоченность в расположении нанотрубок и ее зависимость от состояния и активности клеток

→ Выращивание культуры клеток или биопленок бактерий на поверхности с включенными нанотрубками выявит механическое воздействие клеток на субстрат, т.к. деформации субстрата приведут к ориентации нанотрубок.