Ученые Московского университета приблизились к решению проблем современной медицинской диагностики с использованим единичных клеток и их органелл путем разработки новых неинвазивных оптических методов анализа.
В эпической саге “Звездные войны” в крови джедаев (или ситхов) и прочих выдающихся личностей, как считается, находится очень много мидихлориан — разумной микроскопической формы жизни, находящейся внутри всех живых существ, которая является мифическим посредником между живыми существами и Силой. Наличие большого количества мидихлориан внутри живого существа является совершенно необходимым условием для вступления в орден рыцарей-джедаев (о ситхах сага умалчивает).
На самом деле, в нас и правда есть нечто, что придает нам силу и дает возможность жить. И это – митохондрии, которые выполняют в реальности почти то же самое, что делали в “Звездных войнах” мидихлорианы. Как известно, митохондрии - это органеллы размером около микрона, обычно в эукариотических клетках содержится около 2000 митохондрий, общий объем которых составляет до 25% от общего объема клеток. Митохондрия ограничена гладкой внешней мембраной, однако имеет еще и складчатую внутреннюю мембрану с очень большой поверхностью, складки которой входят в матрикс митохондрий и образуют кристы (см. рисунок). Митохондрии являются генератором универсального топлива (АТФ) для организма за счет окислительного фосфорилирования, а также активно участвуют в превращении пирувата в ацетил-КоА, цитратном цикле, цикле мочевины, синтезе гормонов, поставляют клетке продукты промежуточного метаболизма и помогают поддерживать концентрацию Са2+ в цитоплазме на постоянном низком уровне. Для выполнения основных функций во внутреннюю мембрану митохондрии встроены специальные белковые комплексы, один из которых в процессе своей работы буквально становится похож на вращающую мельницу или ротор наноробота.
В целом, дыхательная (электронтранспортная) цепь митохондрий похожа на осторожное и аккуратное путешествие по лесенке оксилительно–восстановительных реакций и для этого включает в себя три белковых комплекса (комплексы I, III и IV), сукцинатдегидрогеназу (комплекс II) и подвижные молекулы – переносчики, в том числе органический убихинон, обожающий жить и ползать в “жирной” мембране (кофермент Q), и комплекс железа с изменяемой степенью окисления переходного металла, небольшой водорастворимый гемсодержащий белок цитохром с, способный к плаванию в межмембранном пространстве (см. рисунок). АТФ-синтаза (комплекс V), не принимает непосредственного участия в переносе электронов, однако именно она генерирует АТФ за счет градиента протонов. При окислении НАДН + Н+ комплекс I переносит электроны на убихинон. Образующиеся при окислении сукцината, ацил-КоА и других субстратов электроны переносятся на убихинон комплексом II, при этом окисленная форма кофермента Q восстанавливается в ароматический убигидрохинон. Последний переносит электроны в комплекс III, который поставляет их на цитохром с, а он, в свою очередь, переносит электроны на себе к комплексу IV, цитохром с-оксидазе. И вот тут уже цитохром с-оксидаза отдает электроны основному окислителю – молекулярному кислороду. При восстановлении кислорода образуется вода, для чего требуются два протона, поэтому перенос электронов неизбежно сопряжен с возникновением градиента протонов, потому что белковые комплексы вшиты во внутреннюю мембрану, которая сама по себе не пропускает протоны (на то она и мембрана). Перенос протонов должен происходить из матрикса в межмембранное пространство, и лишь АТФ-синтаза позволяет осуществить обратное движение протонов в матрикс, чтобы весь цикл был непрерывен, при этом как раз и формируется АТФ. Перенос протонов помпой (насосом) АТФ-синтазой осуществляется за счет наличия встроенного во внутреннюю мембрану протонного канала и «ручки» (ротора) каталитической части АТФ-синтазы, которая обращена в матрикс митохондрии. "Ствол" этого своеобразного вращающегося насоса образуют полипептиды в протонном канале и часть “ротора”. Цикл перекачки протонов (каталитический цикл) состоит из трех стадий: связывание АДФ, формирование фосфоангидридной связи и освобождение конечных продуктов, включая АТФ. При каждом переносе протона через белковый канал в матрикс все три активных центра на “роторе” катализируют очередную стадию реакции. При этом энергия протонного транспорта прежде всего расходуется на поворот и изменение конформаций субъединиц, из которых и состоит данная “наноэлектромеханическая” система (НЭМС). Очевидно, что достаточно сложно исследовать такую систему без ее разрушения, но ученые Московского университета умудрились сделать и это.
Одним из уникальных семейств методов, которые естественным образом позволяют “увидеть”, что же именно происходит за нежными и чувствительными клеточными мембранами, является спектроскопия гигантского комбинационого рассеяния (ГКР или SERS, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy). Этот метод сочетает в себе несколько важных факторов, которые делают его методом выбора для наблюдения за биохимическими и биологическими процессами. Во–первых, этот оптический метод анализа позволяет снизить мощность “потребляемого” в этом методе лазерного излучения более, чем на порядок величины, что позволяет сохранить в целости и сохранности тот биологических объект, который подвергается изучению. Во–вторых, чувствительность ГКР такова, что позволяет получить спектральные характеристики от отдельных молекул, поскольку коэффициенты усиления колебательных спектров достигают миллионов и миллиардов раз в присутствии плазмонных наноструктур. При правильной наноструктуре ГКР работает хорошо, без наноструктур метод не работает вовсе, потому что металлические наноструктуры (серебро, золото) в силу своих физических особенностей “концентрируют” электромагнитное поле вблизи своей поверхности при воздействии лазерного излучения. Эта особенность означает, что ГКР может почувствовать молекулы и биомолекулы в предельно низких концентрациях, то есть дает, собственно, возможности мониторинга различных интермедиатов биохимических процессов, следы которых сложно обнаружить какими–либо другими методами, в том числе тех процессов, которые протекают в живых клетках. В–третьих, при использовании ГКР в ряде случаев возможна оценка численных значений концентраций молекул на уровне наномолярных концентраций, и главное, на выходе получается спектр, то есть запись всех возможных, разрешенных, колебаний, позволяющих не только достоверно опознать молекулу, в том числе по колебаниям в области “отпечатков пальцев” (fingerprints) молекулы, но и получить информацию о ее конформации (структуре), которая может меняться закономерным образом в биологических процессах. В–четвертых, для реализации метода ГКР совсем не обязательно осуществлять прямой физический контакт. Существенное усиление спектральных характеристик происходит на расстояниях вплоть до 10 – 15 нм от поверхности наноструктуры. С учетом того, что это расстояние сопоставимо с толщинами мембран различных клеток и клеточных органелл у животных и человека, становится возможной неинвазивная трансмембранная диагностика таких биологических структур.
В ходе выполнения проекта РФФИ (17-03-01067) было вновь успешно показано, что серебряные наноструктурированные поверхности позволяют получать спектры ГКР от различных биологических объектов в широком спектральном диапазоне при различном лазерном возбуждении с длинами волн 488, 514, 532 и 633 нм. Такая универсальность полученных наноматериалов объясняется их особой иерархической структурой, что также обеспечивает хорошую адгезию различных биообъектов, включая клетки и органоиды. При использовании лазерного возбуждения с длинами волн 488, 514 и 532 нм от разбавленной суспензии митохондрий, помещенной на наноструктуры серебра, можно зарегистрировать интенсивные спектры ГКР, соответствующие спектру ГКР гема цитохрома С дыхательной (электрон-транспортной, ЭТЦ) цепи митохондрий. При этом другие цитохромы ЭТЦ не вносят вклад в ГКР спектр суспензии митохондрий, что связано с большим расстоянием от них до поверхности наноструктур и отсутствием усиления сигнала КР за счет плазмонного резонанса. В случае лазера 488 нм наиболее интенсивными пиками являются пики, соответствующие симметричным колебаниям колец пирролов и плоскостным колебаниям метиновых мостиков, соответственно, в окисленном цитохроме С. При этом, лазерное возбуждение 488 нм приводит к появлению спектра ГКР с наиболее выраженным пиком с положением максимума 1370 см-1 в случае отсутствия субстратов ЭТЦ митохондрий, однако при внесении субстратов – малата, пирувата, сукцината – и АДФ, необходимого для синтеза АТФ на АТФ-синтазе митохондрий происходит существенное увеличение интенсивности пика с положением максимума 1580 см-1, который по интенсивности становится больше пика 1370 см-1. Такие изменения спектра говорят об изменении конформации гема цитохрома С в работающей ЭТЦ митохондрий. В условиях, когда межмембранное пространство митохондрий уменьшено за счет набухания матрикса при внесении субстратов ЭТЦ и инициации синтеза АТФ можно наблюдать появление низкоинтенсивного плеча на 1350 см-1, которое связано с симметричными колебаниями пиррольных колец в восстановленном геме цитохрома С.
Для того, чтобы изучить изменения конформации гема цитохрома С при развитии сердечно-сосудистых заболеваний, был проведен анализ групп лабораторных крыс с гипертонией на начальной стадии развития и с выраженными патологическими изменениями. При ранней стадии развития артериальной гипертонии по сравнению со здоровыми крысами не наблюдалось увеличения образования АФК и продуктов перекисного окисления липидов в митохондриях, выделенных из кардиомиоцитов, что свидетельствует об отсутствии выраженного окислительного стресса в сердечных мышцах. При поздней стадии развития артериальной гипертонии наблюдали незначительное увеличение образования продуктов перекисного окисления липидов митохондрий кардиомиоцитов по сравнению со здоровыми контрольными животными. При этом, в спектрах ГКР митохондрий кардиомиоцитов больных крыс наблюдалось бОльшее увеличение относительной интенсивности пика 1638-1640 см-1 по сравнению с пиком 1371 см-1, чем в спектрах ГКР митохондрий здоровых крыс. Возможно, появление цитохрома С с гемом в плоской конформации у животных с артериальной гипертонией в поздней стадии развития является адаптивным механизмом, позволяющим оптимизовать работу ЭТЦ и перенос электронов для того, чтобы поддерживать нужный синтез АТФ.
Таким образом, статистический анализ соотношений интенсивностей пиков ГКР в спектрах интактных органелл помогает выявить признаки патологических и/или адаптационных изменений в свойствах и функционировании митохондрий и тем самым сделать шаг на пути к новым типам будушей медицинской диагностики.
Работа поддержана РФФИ (проект 17-03-01067).
