Трудно себе представить, сколько раз за последние несколько десятилетий научное сообщество слышало такое словосочетание как «адресная доставка лекарств». И не случайно, так как эти магические три слова, реализованные на практике, могут совершить коренной переворот в современной медицине. По прогнозам бизнесменов, к 2018 году к реализации препаратов для адресной доставки лекарств должны приступить 19 компаний. Однако на сегодняшний день ни одна подобная методика в терапии заболеваний человека (по различным причинам) все еще не была осуществлена. Естественно, что значимость разработки новых способов адресной доставки лекарств, которые действительно будут иметь практическое применение в обозримом будущем, от этого только увеличивается.
Впервые о возможности адресной доставки лекарств заговорил в конце XIX века великий немецкий бактериолог П.Эрлих, предложив термин «волшебная пуля», подразумевающий препарат, который избирательно находит в организме и убивает опухолевые клетки, не повреждая при этом здоровые ткани. В современном научном мире под адресной доставкой лекарств (перевод английского определения targeted drug delivery) понимают направленный транспорт лекарственного вещества в заданную область организма, органа или клетки. Почему же это направление исследований является столь заманчивым для ученых?
Для того чтобы лекарство было эффективным, важно, чтобы его молекулы попали к нужным клеткам: антидепрессанты попали в мозг, противовоспалительные средства – в места воспалений, антираковые препараты – в опухоль и т.д. Обычно лекарство попадает в больной орган пассивным образом через кровеносную систему (будучи введенным туда в виде инъекций, либо всасыванием из пищеварительной системы). В терапии трудноизлечимых на сегодняшний день заболеваний определяющую роль играет подбор оптимальной концентрации препарата в очаге поражения. В подавляющем большинстве случаев никто не может гарантировать, что нужная доля лекарственного вещества, введенная в организм, на самом деле достигла цели. В действительности большая часть целевого препарата попадает в печень, а также выводится из организма при помощи выделительной системы. Наиболее очевидным решением этой проблемы является повышение начальной концентрации вводимого препарата. Но здесь мы сталкиваемся с другой проблемой - многие лекарства в этом случае могут стать токсичными, то есть, оказывая лекарственное воздействие на одни органы, будут подавлять жизнедеятельность других. Это особенно важно для противораковых препаратов, которые убивают не только больные, но и здоровые клетки.
Именно поэтому учеными всего мира ведутся активные работы по адресной доставке лекарств, которые будут попадать точно в цель, не повреждая других органов. Осуществление данного способа доставки лекарственных препаратов обладает определенными особенностями.
Лекарство должно быть заключено в некоторую оболочку или контейнер (Рис.1) для того, чтобы оно не вступало в химические реакции по пути к больному органу, а начало действовать лишь в нужном месте. К контейнеру предъявляется ряд требований:
- Материал контейнера не должен сам вступать в химические реакции, которые нарушат взаимодействие лекарства с больными клетками.
- Материал контейнера должен каким-либо образом способствовать собственному транспорту в требуемое место в организме. Обычно это достигается наличием в его составе специальных молекул, которые химически «узнают» молекулы в клетках органа, к которому предполагается доставить лекарство (например, антител).
- Само строение и состав контейнера должны позволять осуществлять контролируемое высвобождение лекарства в требуемый момент времени.
Рис. 1. Схематическое изображение контейнера для доставки лекарств на примере липосомы – пузырька, сформированного бислоем липидов (1), лекарство может находиться либо в слое (2) либо внутри (3). Поверхность липосомы покрыта защитным полимером (4), показаны молекулы антител (5)
Наибольшую проблему на сегодняшний день представляет именно выпуск лекарственного вещества из контейнера, который, как правило, требует дистанционного регулирования. Как сделать так, чтобы, например, оболочка капсулы, находящейся в больном органе (недоступная для непосредственного воздействия), непроницаемая сейчас, через несколько минут стала проницаемой, позволяя лекарству выйти наружу?
В этом смысле привлекательным является использование для адресной доставки наночастиц с магнитным ядром и полимерной оболочкой, в которой, собственно, содержатся лекарственные соединения (Рис.2).
Рис. 2. Наночастица с магнитным ядром (1) и полимерной оболочкой (2)
Смысл такой конструкции состоит в том, что дистанционным «переключателем» активности лекарственного вещества в этом случае может выступать магнитное поле. Оно может воздействовать двумя путями: термически и механически. В каком случае доминирует каждое из этих воздействий?
Чтобы это понять, рассмотрим поведение магнитных частиц в магнитном поле. Будем изучать случай, когда частицы состоят из молекул, обладающих собственным магнитным моментом (обусловлен внутренним движением электронов), например, железо (Fe) или его оксид (Fe3O4). Соответственно, вся частица также будет обладать некоторым суммарным магнитным моментом, причем его направление будет произвольным относительно магнитных моментов других частиц.
Если поместить такие частицы во внешнее магнитное поле (например, внутрь катушки с обмоткой, по которой течет ток), то оно будет стремиться повернуть первоначально хаотически ориентированные магнитные моменты частиц в одну сторону. Есть два способа сделать это – сама частица остается неподвижной, поворачивается только ее магнитный момент, либо магнитный момент остается неподвижным относительно частицы, а она нужным образом поворачивается сама. Первый способ называется Неелевской релаксацией, второй – Броуновской релаксацией (Рис. 3). Если по катушке будет течь переменный (меняющий направление во времени) ток, то внешнее магнитное поле также будет меняться во времени с определенной частотой, и соответственно, варьироваться частота поворотов самой частицы или ее магнитного момента.
Рис. 3. Иллюстрация поведения магнитных частиц в магнитном поле. Слева – магнитное поле H равно нулю. Справа сверху – поворот магнитного момента m в неподвижной частице (Неелевская релаксация), справа снизу – поворот самой частицы, магнитный момент неподвижен (Броуновская релаксация) N и S – обозначения полюсов магнита.
Довольно сложные расчеты, которые в этой статье мы обсуждать не будем, показывают, что тип релаксации для конкретной магнитной частицы определяется ее размером. Например, в водном растворе при комнатной температуре для частиц магнетита Fe3O4 размером менее 10-8 м преобладает релаксация по Неелю, размером более 10-8 м – преобладает релаксация по Броуну.
В обоих случаях выделяется определенное количество тепла, но при релаксации по Неелю оно существенно больше. Это связано с внутренними перестройками структуры вещества, а именно упорядочением, выстраиванием магнитных моментов электронов параллельно друг другу в новом направлении при изменении направления поля. Для простоты данный процесс можно сравнить с выделением тепла при кристаллизации различных соединений, где также происходит упорядочение положений частиц в пространстве. Количество выделяемого тепла пропорционально силе магнитного поля и его частоте.
На явлении Неелевской релаксации основано термическое влияние магнитного поля, то есть, локальный нагрев, который можно осуществить внутри организма, регулируя его магнитным полем извне. Данный подход развивается достаточно давно, и в первую очередь известен многим как магнитная гипертермия – терапия, основанная на локальном нагреве магнитных частиц внутри поврежденной клетки, ткани или органа до температур 44 - 45°С полем высокой частоты. При достижении таких температур происходит гибель клеток за счёт разрушения структуры белков – неотъемлемых составляющих любой клетки. Применительно к адресной доставке лекарств с помощью частиц с магнитным ядром и полимерной оболочкой явление гипертермии можно использовать для изменения свойств полимеров при увеличении температуры (становятся проницаемыми для определенных веществ). Если речь идет о геле или пористой оболочке, то при нагреве происходит изменение размера пор (индивидуальное для каждого вещества, может наблюдаться как термическое расширение, так и коллапс – резкое уменьшение объема), и скорость выхода лекарства из частицы может контролируемо возрастать (Рис.4).
Рис. 4. Высвобождение лекарства при термическом действии магнитного поля. Слева – до действия поля, справа – при действии магнитного поля. Приставка «нано-» означает, что характерный размер частиц (в случае наногеля – пор) составляет порядка 1-10 нанометров (10-9 м).
В случае Броуновской релаксации термическое влияние поля крайне мало и может быть вызвано только рассеянием энергии в форме тепла в результате трения частиц о молекулы растворителя, которым можно пренебречь. Преобладающим здесь является механическое влияние магнитного поля, которое может реализовываться при повороте магнитной частицы как целого. Именно на явлении Броуновской релаксации и основан исследуемый нами подход к дистанционному регулированию скорости биохимических реакций, который к настоящему времени практически не изучался.
Главную мысль работы можно выразить всего двумя предложениями. К поверхности магнитных частиц мы химически пришиваем белковые молекулы, затем помещаем полученные комплексы в переменное магнитное поле. При этом оно заставляет первоначально неупорядоченные магнитные моменты частиц ориентироваться в одну сторону (вызывая поворот самих частиц), что приводит к деформации растяжения, сжатия, скручивания прикрепленных к ним белковых молекул. Но как применить описанный эффект к управлению реакциями в организме? В этот момент нужно уточнить, что к поверхности магнитных частиц мы пришиваем не просто белковые молекулы, а молекулы фермента.
Ферменты – биологические катализаторы, облегчающие протекание многих реакций в организме. Их важным отличием от неорганических катализаторов, помимо высокой молекулярной массы (например, молекулярная масса используемого в нашей работе белка составляет 25000 г/моль), является структурная чувствительность и, как следствие, высокая специфичность. Ферменты образуют комплекс с субстратом – веществом, которое в процессе химической реакции превратится в другое (продукт) (Рис.5).
Рис.5. Схематическое изображение реакции с участием фермента. Активный центр – главная часть фермента, без которой невозможен катализ с его участием.
Структуры фермента и субстрата подходят друг к другу, как ключ к замку. Если структура фермента каким-либо образом исказится, это немедленно скажется на прочности его связи с субстратом, а значит, и на эффективности превращения субстрата в продукт, то есть, приведет к снижению скорости реакции вплоть до нуля (говоря научным языком, произойдет снижение каталитической активности фермента). Таким образом, в наших исследованиях мы рассчитываем регулировать скорость определенных биохимических реакций в организме, механически изменяя структуру фермента, который эти реакции катализирует. При этом фермент химически закреплен (или, по-другому, химически иммобилизован) на поверхности магнитных частиц. Какие же результаты есть на сегодняшний день?
Во-первых, были получены водные растворы самих комплексов магнитных частиц с ферментом (Рис.6). При этом использовались частицы магнетита Fe3O4, уже упоминавшегося ранее (диаметром 8-10 нм), и химотрипсин – фермент, катализирующий гидролиз - расщепление химической связи под действием воды, содержащийся в секрете поджелудочной железы человека и участвующий в расщеплении белков пищи в тонком кишечнике (Рис.7). Химотрипсин присоединялся к магнитным частицам при помощи промежуточных молекул – линкеров, которые способны образовывать связи как с магнетитом, так и ферментом.
Рис. 6 Микрофотография (слева) и схематическое изображение пришивки фермента (справа) в комплексах химотрипсина и магнитных частиц Fe3O4.
Рис. 7 Магнитные частицы Fe3O4 (слева), схематическое изображение химотрипсина (справа).
Во-вторых, необходимо было решить проблему – как зафиксировать изменение каталитической активности фермента, если оно произойдет? Для этого была выбрана модельная химическая реакция гидролиза субстрата пара-нитроанилида-N-бензоил-L-тирозина (BTNA), катализируемая химотрипсином (Рис.8), продуктом которой является пара-нитроанилин, окрашенный желтым цветом. За тем, как протекает эта реакция, удобно следить при помощи спектрофотометра – прибора, способного измерять оптическую плотность или, проще говоря, интенсивность окраски раствора, в зависимости от времени. Скоростью реакции в данном случае называли отношение разности оптических плотностей раствора в моменты времени t2 и t1 к промежутку времени (t2 – t1).
Рис.8. Схема реакции гидролиза выбранного субстрата (BTNA) химотрипсином.
В третьих, были выбраны подходящие параметры для обработки реакционной смеси магнитным полем. Использовалась частота 50 Гц (низкая), воздействие магнитным полем производилось серией из 3-4 выдержек по 3 минуты с перерывами в течение 3-5 минут для того, чтобы построить достоверную зависимость оптической плотности раствора от времени.
Эксперимент выглядел следующим образом. Сначала раствор магнитных частиц с пришитым к ним химотрипсином смешивали с раствором субстрата в рассчитанной заранее пропорции. Затем реакционную смесь делили пополам и помещали в специальные прозрачные емкости для измерения оптической плотности в спектрофотометре (кюветы). Одна из кювет подвергалась действию магнитного поля, в другой кювете в это время просто поддерживали постоянную температуру – она была контрольной, то есть, эталоном скорости, с какой бы шла реакция, если бы не было воздействия магнитного поля. Концентрации фермента и субстрата были подобраны таким образом, чтобы оптическая плотность зависела от времени линейно, то есть, скорость контрольной реакции была постоянной в течение эксперимента.
На Рис.9, слева, представлен типичный вид получаемых зависимостей. Таким образом, в кювете, подвергавшейся действию магнитного поля, наблюдалось замедление реакции после каждой выдержки в поле; в конце эксперимента скорость реакции составляла 65-70% от начальной.
Рис. 9 Кинетика изучаемой реакции в переменном магнитном поле, Обработка в магнитном поле после добавления субстрата (слева), до добавления субстрата (справа). 1 – контрольный образец без обработки в поле, 2 – образец, подвергающийся действию поля.
Получив такой результат, мы решили определить, действительно ли магнитное поле влияет на структуру самого фермента (вариант 1) , или же оно влияет на протекание его реакции с субстратом, то есть, увеличивает время взаимного поиска молекул, время прикрепления их друг к другу, снижая общую скорость реакции (вариант 2). Для этого был сделан контрольный эксперимент, в котором магнитным полем в режиме, описанном для первого эксперимента, мы обрабатывали только раствор фермента. Раствор субстрата был добавлен только после выключения магнитного поля, затем мы просто записывали зависимость оптической плотности от времени для растворов в обеих кюветах, не подвергая их больше никакому воздействию извне (Рис.9, справа). То есть, возможность варианта 2 была исключена. Тем не менее, во втором эксперименте мы также можем видеть замедление реакции, что подтверждает механическое влияние магнитного поля на структуру фермента, то есть, развитие варианта 1
Учитывая описанные выше результаты, имеет смысл вновь задуматься о возможной структуре комплексов, получаемых при химической сшивке магнитных частиц с ферментом. Расчеты показали, что если фермент закреплен только на одной магнитной частице, то при ее вращении может наблюдаться лишь вытягивание молекулы фермента, при этом на него будет действовать сила порядка 10-12Н что, вообще говоря, не привело бы к существенным структурным изменениям и к заметному влиянию на скорость катализируемой им реакции. Но если фермент оказывается прикрепленным к двум и более магнитным частицам, то на него в результате релаксации по Броуну могут действовать силы порядка 10-9-10-10Н, что вполне достаточно для осуществления практически любой деформации молекулы фермента. Поэтому мы предполагаем, что была получена структура, изображенная на Рис.10, где, по крайней мере, часть молекул фермента закреплена более чем на одной магнитной наночастице.
То, что в наших экспериментах не было получено падение скорости катализируемой реакции до нуля, мы объясняем именно присутствием в реакционной смеси как фермента, иммобилизованного на двух и более частицах, так и фермента, иммобилизованного на одной магнитной частице, что практически не влияет на его катализирующую способность. Этот недостаток может быть устранен подбором оптимального соотношения магнитных частиц и фермента на стадии его химической пришивки, а также уменьшением общей концентрации фермента, и не влияет на общий ход рассуждений.
Рис. 10. Предполагаемая структура комплексов, полученных в данной работе. МНЧ – магнитная наночастица, E – молекулы фермента, L – молекулы линкера, mi – магнитный момент частицы, Mi – действующий на нее механический момент, Fi – сила, приложенная к молекуле фермента.
Несмотря на то, что с концепцией механического воздействия на молекулы фермента, иммобилизованного на магнитных частицах, мы внесли определнную ясность, как применить это к регулированию скорости биохимических реакций в организме в рамках адресной доставки лекарств, все еще остается не вполне понятным и требует дополнительного пояснения.
Когда будут подобраны все возможные оптимальные параметры в изучаемой системе, мы будем иметь возможность, включая магнитное поле, полностью лишать фермент каталитической активности, а выключая поле, полностью ее восстанавливать. Наиболее очевидным применением подобного «переключателя» является следующее. Мы можем сначала каким-либо образом ввести в организм лекарственное вещество, для усваивания которого необходим определенный фермент. Затем введем магнитные частицы с иммобилизованным на них нужным ферментом, направляя их при помощи магнитного поля извне (при этом фермент пока еще не будет проявлять каталитической активности, так как будет деформирован силами поля). Когда магнитные частицы достигнут очага поражения (можно зафиксировать методом магнитно-резонансной томографии), выключаем внешнее магнитное поле, и усвоение лекарства идет исключительно в больном органе, терапевтическая эффективность при этом возрастает во много раз. Другой возможный вариант реализации нашей концепции – введенный в организм иммобилизованный фермент катализирует растворение изначально непроницаемой оболочки контейнера с лекарственным препаратом, который также был ранее доставлен в пораженное место. Все это может существенно облегчить лечение многих заболеваний, требующих высокой локальной концентрации лекарственных веществ, которые без адресной доставки могут быть токсичны.
Таким образом, обнаруженный нами эффект является перспективным для осуществления контролируемого усвоения, а также выпуска лекарств из контейнера в рамках концепции адресной доставки лекарственных препаратов с использованием магнитного поля в качестве дистанционного «переключателя». Мы надеемся, что в скором времени нам удастся провести описанные выше эксперименты in vivo и перейти к планированию коммерческого использования систем на основе лекарств, связанных с магнитными частицами.
