Ключевым требованием к терапевтическому использованию лекарственных препаратов является возможность пространственного и временного контроля их высвобождения. Один из перспективных способов достижения этой цели – создание из биоразлагаемых полимеров наночастиц с инкапсулированными медикаментами. Группа американских ученых разработала технологию, основанную на использовании нанопористой мембраны, разделяющей две жидкости. При перекачивании одной жидкости в другую можно получить наночастицы на выходах из пор мембраны.
В качестве полимера-образца в работе использован хитозан, биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид, широко применяющийся в фармацевтике и биомедицине. Известно также, что хитозан является pH-чувствительным полимером: при низких значениях pH амины хитозана протонированы и положительно заряжены, и хитозан таким образом превращается в водорастворимый катионоактивный полиэлектролит. При высоком pH амины депротонируются, полимер теряет свой заряд и становится нерастворимым.
Экспериментальная установка (рис. 1) состоит из нанопористой мембраны, которая разделяет две жидкости. рН исходной жидкости позволяет хитозану раствориться в ней. Исходный раствор перекачивается сквозь поры мембраны во второй раствор (справа на рис. 1). рН второго раствора не дает хитозану раствориться. Таким образом, когда нанокапли растворимого хитозана проникают во второй раствор через мембрану, на выходах из нанопор образуются хитозановые наночастицы. Для получения наночастиц необходимы мембраны с одинаковыми и цилиндрическими нанопорами. В этой работе были использованы коммерчески доступные трековые поликарбонатные (ПКТ) и анодные алюминиево-оксидные (ААО) нанопористые мембраны (рис. 2).
Исходный раствор содержит 25 мг хитозана в 20 мл 10-3 M HCl (pH = 3.0). Второй раствор представляет собой 10 мл 10-3 M NaOH (pH = 11). Площадь мембраны одинакова в случае ПКТ и ААО мембран и составляет 2 см2. Растворы поместили на разной высоте, создав тем самым безнапорный поток, при котором раствор с низким рН перетекал в раствор с высоким рН.
Нанокапли образовались у отверстий ПКТ нанопористой мембраны при контакте с раствором с высоким рН, вызвавшим образование хитозанового осадка. Хитозановые наночастицы сразу же удалялись от мембраны благодаря непрерывному безнапорному потоку. При этом засорения мембран хитозановыми наночастицами зафиксировано не было. При помощи фильтрации наночастицы были выделены собраны из второго раствора, трижды промыты деионизированной водой и высушены на воздухе при комнатной температуре.
Для инкапсуляции препаратов был использован родамин 6G (R6G) как модельный объект, имитирующий молекулу медикамента (R6G - один из наиболее часто используемых флуоресцентных красителей). Это позволяет быстро определить количество инкапсулированного вещества с использованием флуоресцентных методов: высушенные частицы растворяются в фосфатно-цитратном буфере при рН=3 и анализируется полученный раствор. В эксперименте был предварительно получен раствор хитозана с массовой долей R6G 5%. На рис. 3 представлены ПЭМ изображения хитозановых наночастиц, содержащих R6G, полученных при помощи ПКТ и ААО мебран, соответственно. При помощи ПКТ и ААО мембран из исходного раствора хитозана, содержащего 5.0% R6G, были получены наночастицы, содержащие 2.7% и 3,3% инкапсулированного родамина. Производительность мембран составляет 4,2 мкг/час для ПКТ и 610 мкг/час для ААО мембран. Такая значительная разница обусловлена огромной разницей в количестве пор на единицу площади мембраны. На рис.4 представлены распределения хитозановых частиц, содержащие родамин. В случае ААО мембран диаметр частиц оказывается больше, что может быть объяснено тем, что диаметр мембран ПКТ на контакте с раствором составляет 10 нм, а в случае ААО мембран – 20 нм.
Были проведены исследования влияния величины потока на размер частиц (рис.5). Она менялась от 7,2 до 32 мкл/мин*см2 при изменении разницы высот (рис.1). Используя динамическое светорассеяние. удалось установить экспоненциальный характер зависимости поток-размер частиц, причем монодисперсность полученных систем падает при увеличении потока. Интересно, что при высоких величинах потока формируются полые нанотрубки и нанонити.
Также была измерена зависимость размера частиц от вязкости (Рис.6), которую можно контролировать добавлением глицерина. Очевидно, вязкость влияет на коэффициент диффузии, что обуславливает преимущественное образование больших частиц. Вероятным объяснением выхода кривой на насыщение при высоких значениях вязкости служит то, что, достигнув определенного размера, частицы начинают отделяться от мембраны под действием гравитации и дальнейшее увеличение вязкости не приводит к значительным изменениям размера при одной и той же величине потока.
Перетекающая сквозь нанопористую мембрану жидкость позволяет включить посторонние молекулы в хитозановые частицы. Различные органические составляющие могут быть включены и в другие биоразлагаемые полимерные системы, что предполагает практическое использование этого метода в подготовке препаратов для доставки в форме наночастиц.
Оригинальная статья "General Method for Producing Organic Nanoparticles Using Nanoporous Membranes" была опубликована 25 марта 2010 года в Nanoletters.
