Динамика конформационных изменений белковой молекулы под действием внешних импульсов является важным для изучения биологических процессов, однако исследование этой динамики чрезвычайно затруднено. Однако, применение высокоскоростной АСМ помогает решить эту проблему. На данный момент существует возможность съемки с временным разрешением 30 мс, однако цикл фотовозбуждения бактериородопсина составляет всего 10 мс, поэтому в работе применялся мутантный бактериородопсин, цикл фотовозбуждения которого составляет около 10 с.
Белковая молекула бактериородопсина, динамику которого и изучали исследователи, состоит из нескольких альфа-спиралей (особых трехмерных структур), обозначаемых A-F, соединенных переходными участками. Кроме того, молекулы бактериородопсина на цитоплазматической мембране существуют в виде тримеров. Положение альфа-спиралей отдельных мономеров в процессе возбуждения может меняться, что и будет отражаться при атомно-силовой микроскопии. На Рис.1а и Рис.1b представлены результаты сканирования, стрелки указывают смещение выступов во времени, при этом происходит вращение выступов относительно центра тримера.
В процессе фотовозбуждения молекула бактериородопсина меняет конформацию, в результате чего открываются протонные каналы цитоплазматической мембраны. Однако точный механизм этого неизвестен, так же, как неизвестно, какие именно альфа-спирали участвуют в открытии канала – экспериментальные данные, полученные разными научными группами, сильно расходятся. В результате обработки сканов АСМ установлено, что происходит поднятие связки между спиралями E и F, при этом происходит их смещение (Рис.1с).
При изменении рН среды, стабильность промежуточных конформаций также изменяется (Рис. 1d). В качестве подтверждения того, что данные АСМ представляют динамику молекулы, а не являются случайными артефактами, ученые сравнили результаты спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой области с данными АСМ-сканирования при различных рН. Данные, полученные двумя методами, хорошо согласуются между собой, однако время релаксации, полученное методом АСМ, оказывается немного большое, что может свидетельствовать о наличии неописанных ранее промежуточных состояний.
Особенно интересными являются результаты, представляющие кооперативные эффекты. Оказывается, при возбуждении бактериородопсина мономеры объединяются в структуры, названные трилистниками. Механизм возбуждения мономеров, составляющих трилистник, оказывается довольно сложным – при малой интенсивности возбуждающего света возбуждение отдельного мономера подчиняется экспоненциальному закону (Рис.2, верх), но при более интенсивном освещении тот мономер, которых возбудился позже, чрезвычайно быстро релаксирует (Рис.2, середина), в то время как ранее возбудившийся мономер трилистника теряет энергию существенно дольше (Рис.2, низ) и не по экспоненциальному закону. Стоит отметить, что интегрально возбуждение светом малой и большой интенсивности не различаются по длительности, и описанный механизм, включающий перенос энергии в пределах трилистника, не может быть зафиксировано никакой методикой, предполагающей усреднение.
Таким образом, высокоскоростное АСМ-сканирование является перспективным методом изучения молекулярной динамики, позволяющим изучать различные нюансы процесса, которые недоступны для других методов.
