Ежегодно только в США от рака мозга умирает около 13000 человек, что делает исключительно актуальным вопрос поиска новых эффективных препаратов для его лечения. Уже давно в качестве потенциальных кандидатов выступают композиты наноматериалов с биомолекулами, позволяющими селективно распознавать и целевым образом уничтожать раковые клетки. В качестве фотокатализатора процессов деградации и деактивации вирусов и микроорганизмов хорошо известен диоксид титана TiO2, который проявляет эффект цитотоксичности по отношению к некоторым опухолям под действием УФ излучения, но определенные ограничения при его использовании связаны со случайностью в выборе клетки - мишени. Для борьбы со злокачественной астроцитомой эту проблему стало возможно обойти путем сопряжения модифицированного оксида титана с биополимерами, способным селективно распознавать раковые клетки. Известно, что рецептор интерлейкина-13a2 (IL13a2R) может связываться с интерлейкином-13 (IL13) – важнейшей сигнальной молекулой опухолей - с последующим проникновением всего комплекса в клетку. Это делает его идеальным кандидатом на роль маркера раковых клеток. Работа такого терапевтического комплекса основана на поглощении видимого света 5-нанометровыми наночастицами TiO2, которые затем передают возбуждение на молекулярный кислород, образуя при этом цитотоксичные активные метаболиты кислорода (АМК). Такие наночастицы могут также (что, конечно, важно) преодолевать биологические барьеры, такие как гематоэнцефалический.
В ходе работы по стандартной методике были получены наночастицы TiO2, покрытые глицидилизопропилэфиром для предотвращения нежелательных реакций гидроксогрупп на поверхности TiO2. Наночастицы были ковалентно связаны с антителом для целевого IL13a2R через 3,4-дигидроксифенилуксусную кислоту (DOPAC), которая, с одной стороны, модифицирует поверхность TiO2, в результате чего он поглощает видимый, а не УФ, свет, а также подготавливает частицу к связыванию с биомолекулой. После выделения и очистки полученного композита TiO2-DOPAC-anti-IL13a2R было показано, что "когнитивная" биоактивнсть anti-IL13a2R снижается при этом всего на 10%, тогда как атипичный иммуноглобулин не обладал способностью распознавать IL13a2R. Кроме того, отклик anti-IL13a2R линейно зависел от концентрации при c<1 мкг/мл, а при c=1 мкг/мл наблюдалось насыщение, поэтому в экспериментах использовали концентрации 6-600 нг/мл.
Визуализацию процесса взаимодействия лиганд-рецептор и распределения специфических рецепторов в отдельной раковой клетки проводили методом рентгеновской флуоресцентной спектроскопии, которая является проверенным методом анализа распределения металлов в клетках бактерий и млекопитающих. Модельные эксперименты, для которых использовали клетки A172 из-за высокой активности IL13a2R, показали, что титан распределен по всей клеточной мембране. Кроме того, композитом покрыта и инвадоподия – специфический богатый актином отросток микронного размера некоторых раковых клеток, что может стать важным шагом для диагностики раковых заболеваний.
Активность синтезированного композита определяли по потере целостности клеточной мембраны, контролируя выделение клеточной лактодегидрогеназы. Были протестированы клетки A172, U98 и человеческих астроглиоцитов. В качестве образцов сравнения были исследованы клетки, не содержащие наночастиц. Было показано, что в темноте, равно как и при отсутствии биомолекулы, активность отсутствует. Композит с атипичным иммуноглобулином также не проявляет цитотоксичности. При этом цитотоксичность композита c anti-IL13a2R сохраняется в течение не менее 48 часов.
Давно установлено, что фотовозбуждение водного раствора TiO2 приводит к образованию АМК, таких как гидрокси- и перокси-радикалы OH• и HO2•, супероксид-анион O2–, перекись водорода H2O2 и синглетный кислород. Методом ЭПР было ранее установлено, что основным продуктом при использовании TiO2, связанного с биомолекулами через катехолятный мостик, является супероксид-анион. Это же наблюдалось и в случае композита TiO2-DOPAC-anti-IL13a2R. Его активность существенно понижалась в присутствии супероксид дисмутазы ("поглотителя" супероксид-аниона), азида натрия (ловушки OH• и синглетного кислорода) и немного меньше – каталазы (разлагающей пероксид водорода). Гистидин же (другая ловушка для синглетного кислорода) и маннитол (ловушка гидроксильных радикалов) лишь немного замедляли его активность. Совокупность этих данных и данных ЭПР подтверждает, что основной формой АМК, обуславливающией цитотоксичности, является супероксид-анион. Токсичность АМК обусловлена некрозом ("убийством") клеток при образовании короткоживущих частиц (~нс) или апоптозом ("самоубийством" клеток) в случае долгоживущих (~мс), к которым и относятся O2–, H2O2 и HO2.
