Публикации: Биотехнологии

(ДРЕВОВИДНЫЕ ПЕПТИДЫ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ С-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА АЛЬФА-СПИРАЛИ ДОМЕНА АЛЬФА-2 МОЛЕКУЛ MHC КЛАССА I: ВЛИЯНИЕ НА ВНУТРИТИМУСНУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ Т-ЛИМФОЦИТОВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ВВЕДЕНИЮ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК)

Целью данного исследования являлось выяснение механизма иммуностимулирующего действия мультиплетных пептидов (дендримеров), в частности, их воздействия на процессы внутритимусной дифференцировки и выживание животных, получивших летальную дозу опухолевых клеток. С применением цитофлуориметрического анализа субпопуляций тимоцитов, выделенных из органных культур эмбрионального тимуса, показано увеличение доли однопозитивных тимоцитов, экспрессирующих CD3. Показана способность синтезированных конструкций к продлению жизни мышей bm1, получивших летальную дозу клеток тимомы EL4.

Ранее нами показано, что линейные пептиды с последовательностью сайта контакта домена альфа-2 молекул MHC класса I с TCR способны к индукции супрессорных функций Т-лимфоцитов in vivo и к их антигениндуцированной гибели in vitro [1, 7]. Такая биологическая активность может быть связана с тем, что этот участок формирует наиболее вероятный сайт консервативного взаимодействия молекулы MHC с TCR, обусловливающий избирательность во взаимодействии рецепторов Т-клеток с молекулами MHC [2]. Для повышения иммуногенности мы создали древовидные пептиды с последовательностью AA158-175, соответствующей области контакта альфа-2 домена молекул MHC класса I с Т-клеточным рецептором [6, 8]. Подкожная иммунизация экспериментальных животных такими конструкциями приводит к увеличению доли клеток CD4⁺ в периферических лимфоидных органах реципиентов, стимуляции иммунного ответа Т-клеток на аллоантигены и влияния на дифференцировку Т-клеток in vivo [4]. В органных культурах тимуса эффект высоких концентраций тетрамеров сходен с эффектами, вызываемыми суперантигенами [5].

В данной работе мы исследовали влияние древовидных пептидов на дифференцировку Т-лимфоцитов в органных культурах тимуса в широком диапазоне концентраций, а также возможность их использования для повышения резистентности экспериментальных животных к введению летальных доз опухолевых клеток.

Методика исследований

В работе использованы мыши инбредных линий bm1 (K^bm1I^bD^b) и B10.D2 (K^dI^dD^dL^d) вивария ГУ РОНЦ РАМН. Древовидные тетрамеры пептидов 158-175 молекул H-2D^b, H-2K^k и H-2D^b с инвертированной последовательностью аминокислот получали в соответствии с методом [6]. Структура синтезированных тетрамеров представлена на Рис.1. Тетрамеры вводили мышам подкожно в виде раствора в среде RPMI-1640 по схеме (-7-5-3) в суммарной дозе 100 мкг. Клетки тимомы EL4 вводили мышам подкожно в количестве 2 х 10⁶. Для получения органных культур эмбрионального тимуса выделяли доли тимуса 14-16 дневных эмбрионов мышей B10.D2 и культивировали их в среде RPMI-1640 с добавлением глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки на мембранах Transwell (Costar), меняя среду каждые 48 часов в течение 7 дней. Тимоциты анализировали на проточном цитофлуориметре Facscalubur (Becton Dickinson, USA), используя антитела к CD8, меченные аллофикоцианином (APC), антитела к CD4, меченные фикоэритрином (PE), антитела к CD3, меченные изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) (Farmingen, USA). По показателям прямого и бокового рассеяния из анализа исключали эритроциты и клеточные агрегаты. По интенсивности свечения иодистого пропидия (PI) в канале FL3 исключали мертвые клетки. В исследованиях субпопуляций тимуса на приборе анализировали не менее 40 000 событий.

Результаты и обсуждение

Воздействие синтезированных тетрамеров на процессы внутритимусной дифференцировки Т-клеток в органных культурах тимуса мышей B10.D2 оценивали через 7 дней культивирования. Из результатов, представленных на Рис. 2 видно, что внесение в культуры “аллогенного” мультиплетного тетрамера AA158-175K^k в низких концентрациях приводит к двухкратному увеличению доли клеток, экспрессирующих CD3, с одновременным увеличением клеточности органов. “Сингенный” тетрамер AA158-175D^b(L^d) приводит к менее выраженному эффекту (данные не представлены).

Из результатов, представленных в табл. 1, можно заключить, что это повышение затрагивает все основные субпопуляции тимуса, за исключением клеток DN. Это свидетельствует о повышении доли клеток, экспрессирующих TCR, которое может быть интерпретировано как повышение эффективности позитивной селекции. На Рис. 3 показан эффект воздействия мультиплетного тетрамера AA158-175D^b в высокой концентрации (0,1 мкг/мл). Несмотря на общее снижение доли клеток, экспрессирующих CD3, в органных культурах остается фракция клеток с высокой экспрессией CD3, состоящая, главным образом, из клеток DN и CD4^-CD8⁺. Этот результат сходен с эффектом воздействия высоких концентраций пептидного лиганда на органные культуры тимуса животных, экспрессирующих трансгенный TCR, который отмечался ранее другими [9].

Таким образом, данные, полученные при исследовании древовидных пептидов, свидетельствуют об их способности к воздействию на процессы внутритимусной селекции Т-клеток. Препараты такого типа могут оказаться полезными в ближайшем будущем как компоненты противоопухолевых вакцин, стимулирующие иммунный ответ на слабоиммуногенные антигены и способствующие преодолению центральной толерантности к опухолеассоциированным антигенам [3]. Для проверки этой гипотезы мышам bm1 вводили препараты, а затем летальную дозу клеток тимомы EL4 подкожно.

На Рис. 4 представлены диаграммы выживания животных после введения опухолевых клеток. Видно, что выживание животных, получавших “антисенс”, не отличается от контроля. Напротив, введение тетрамерных пептидов в различной мере способствует достоверному продлению жизни животных (Табл. 2). Наблюдались также отдельные случаи неопределенно долгого выживания животных, получивших инъекции тетрамерных пептидов.

В структурном отношении последовательности использованных пептидов можно отнести к региону аномальной укладки альфа-спирали (так называемый "kink-region"). Этот регион интересен тем, что он гомологичен сходному участку, присутствующему в бета-цепях молекул MHC класса II и может служить для "узнавания" молекул гистосовместимости Т-клеточными рецепторами [2]. Основываясь на этой информации, был синтезирован тетрамер с оптимизированной структурой AA152-164D^b, линейная последовательность которого присутствует у мышей bm1 в составе молекулы H-2D^b, то есть является для них сингенной. На Рис. 4 видно, что введение мышам тетрамера AA152-164D^b(L^d) приводит к отчетливо выраженному биологическому эффекту. Это говорит о прямой связи выявленных биологических эффектов с мультиплетной структурой синтезированных конструкций, а не их антигенностью или чужеродным происхождением. Учитывая то, что рецепторы Т-лимфоцитов распознают антигены в виде комплекса линейных пептидов со "своими" молекулами гистосовместимости, можно заключить, что синтезированные конструкции взаимодействуют с рецепторами Т-лимфоцитов напрямую, не проходя классического процессинга в дендритных клетках и макрофагах животного-реципиента.

Эта особенность синтезированных препаратов открывает возможности направленного воздействия на процессы внутритимусной селекции Т-клеток и последующего получения препаратов, способных предотвращать негативную селекцию клонов, специфичных к опухолеассоциированным антигенам.

ЛИТЕРАТУРА

1. Казанский Д. Б., Анфалова Т.В., Хромых Л. М., и др. // Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999, №9, С. 57-60.
2. Казанский Д.Б. // Мотивы в первичной структуре молекул MHC класса I млекопитающих: связь структуры и функций.
3. Д. Б. Казанский. // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии, Оренбург, 2001, С. 36-43.
4. Казанский Д.Б., Силаева Ю.Ю., Анфалова Т.В., и др.// Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001, № 1, С. 48-51.
5. Казанский Д. Б., Побезинский Л. А., Побезинская Е. Л., и др. // Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003, №9, С. 79-83.
6. Скляров Л.Ю., Николаев А.Ю., Копина Н.А. // Итоги науки и техники, Иммунология, 1988, Т.26, С.37-42.
7. Brondz B. D., Kazansky D. B., Chernysheva A. D., et al. // Immunology. - 1995. - V. 86. - P. 219-223.
8. Davis M, Boniface J, Reich Z, et al. // Annu. Rev. Immunol. 1998, V. 16, P. 523-544.
9. Kersh G.J., Engle D.L., Williams C.B., et al., // J. Immunol., 2000, V. 164, P. 5675-5682.