Живая клетка - один из самых интересных объектов для исследования. Неудивительно, что научная братия достаточно давно начала придумывать разные хитрые инструменты для того чтобы залезть внутрь этой самой клетки и чего-нибудь там померить. И желательно, чтобы ни клетка, ни инструмент при этом не поломались.
В этой статье автор попытается рассказать об оптических сенсорах для внутриклеточных измерений, при этом не о всяких, а о достаточно ограниченном классе оптических ион-селективных сенсоров. Поэтому название статьи не надо рассматривать очень серьезно, ибо химические сенсоры весьма многообразны и описать их достаточно полно в одной статье ну никак не получится.
Почему ион-селективные? Как было установлено достаточно давно, электролиты играют огромную роль в различных процессах в живых организмах. К примеру, наш мозг - это такой ионный аналоговый компьютер, в котором электроны заменены на ионы калия и натрия. Тонкий баланс концентраций электролитов внутри и снаружи клеток нашего (и не только нашего) организма поддерживается целой системой сложных процессов ввода-вывода веществ. Между прочим, смертельные инъекции приговоренным к смертной казни в Штатах делаются хлоридом калия. Повышение содержания калия в крови вызывает немедленную остановку сердечной деятельности.
Активный и пассивный трансмембранный транспорт таких ионов как водород, калий, натрий, кальций и хлорид изучается в течение долгого времени. Совсем недавно ученые начали осознавать также роль траспорта таких ионов металлов, как медь и цинк. Дело в том, что медь, например, токсична, но клетке она нужна. Как быть? Ион металла можно сделать "невидимым", связав его в комплекс. Так и делают белки - переносчики ионов металлов. При этом необходимо суметь его вовремя передать по эстафете другому белку. Как белки это делают, где происходит передача и аккумулирование ионов металлов - до сих пор не очень понятно.
Одним из первых, кто понял роль электролитов в живых системах, был датский химик Соренсен, который ввел понятие pH, ввел шкалу pH, и предложил способы измерения этого самого пэАШ. Для справки - пэАШ это отрицательный логарифм активности ионов водорода; почему активности , а не концентрации - об этом позже. Способов, предложенных Соренсеном в далеком 1909, было два. Первый был основан на наборе цветных индикаторов, второй - на измерении разности потенциалов, возникающей на поверхности стеклянной мембраны, позже ее назовут стеклянным электродом. Честь изобретения стеклянного электрода принадлежит Кремеру.
Стеклянный pH-электрод, собственно, и стал первым и самым старым химическим сенсором. С развитием электроники стало возможным сравнительно просто делать высокоомные вольтметры, и пАШ-метр стал неотъемлемой частью химической лаборатории и производства. Мой пАШ-метр даже запускает Internet Explorer и позволяет лазать по Cети, наигрывая mp3 файлы.
Изучая разность потенциалов на мембранах, сделанных из разных материалов, ученые быстро пополнили семейку электродов электродами на ионы галогенов, натрия, серебра, кадмия. В 60-х годах было сделано еще одно важное открытие. Оказалось, что мембрану можно делать жидкой и растворять в ней вещества, селективно связывающие определенные ионы, т.н. ионные переносчики или ионофоры. Первым был натуральный ионофор - антибиотик валиномицин. Позже мембрану сделают из пластифицированного полимера, прилично улучшив ее механические свойства. Огромное преимущество таких электродов заключалось в практически бесконечных возможностях изменения состава мембраны. В швейцарской лаборатории Вилли Симона довольно быстро наварили целую кучу синтетических ионофоров. Сегодня известны ионофоры, селективные примерно к 60 различным ионам.
Вернемся к нашим баранам, то есть к измерениям в клетке. Довольно быстро стало понятно, что ионоселективный электрод (ИСЭ) можно сделать тонким и с острым кончиком диаметром в доли микрона. Нанотехнологий в 60-х годах не было, поэтому такие электроды получили название "микроэлектроды". Их можно было воткнуть в клеточную стенку и измерять активность ионов внутри.
Что-же такое активность? Видите ли, физхимики люди весьма наивные и ленивые. Они думают, что наш мир линеен. Давление пара над раствором прямо пропорционально концентрации растворенного вещества, температуры кипения и замерзания также линейно зависят от состава раствора, и так далее. Потенциал ИСЭ, как выяснилось, линейно зависит от логарифма концентрации иона. Но дудки! Наш мир неидеален, и от линейности происходят отклонения, увы и ах! Что делают ленивые физхимики? Эти наивные люди по - прежнему утверждают, что параметры системы линейно зависят, но... не от концентрации, а от активности. Введя поправочную функцию, именуемую коэффициентом активности, физхимики заваливаются обратно в спячку.
Иными словами, наш "линейный" мембранный электрод измеряет не концентрацию, а активность (кажущуюся концентрацию). Чем выше концентрация электролита, тем более выраженным становится отклонение. И именно эта особенность стала огромным преимуществом ИСЭ перед другими методами анализа. Потому что в живой клетке протекающие процессы контролирует активность, а не концентрация. Для справки: в США производят ежегодно примерно 300 миллионов определения активности калия в крови тем самым валиномициновым электродом.
Изваяв микроэлектроды, исследователи начали с энтузиазмом втыкать их в живые клетки. Единственная проблема заключалась в том, что электрод все-таки повреждал клеточную стенку и занимал довольно много места внутри клетки (до 30% объема). Помните Соренсена и его набор индикаторов? Синтезировав молекулу, избирательно связывающую определeнный ион и при этом меняющую оптические свойства, мы можем ввести ее в клетку. Посмотрев на покрашенную таким красителем клетку в микроскоп, мы можем судить о распределении того или иного иона в цитоплазме. Одним из известных производителей подобных индикаторов стала фирма Molecular Probes, основанная в Юджине, штат Орегон. Неудивительно, что один из красителей называется Орегонский Зеленый.
Но с индикаторами другая проблема: во-первых, клетке может не понравится, что в нее ввели какое-то вещество в приличной концентрации. Во-вторых, содержимое цитоплазмы может запросто начать реагировать с красителем. Тот самый Вилли Симон в 70-х предложил концепцию оптического ион-селективного сенсора. Как он устроен? Очень просто. Это кусочек полимера, в котором растворили ДВА ионофора. Один селективен к ионам, скажем, металла, а другой - к ионам водорода. Только вот этот второй ионофор еще и меняет оптические свойства при связывании иона водорода, совсем как лакмусовая бумажка. Чтобы служба ионофорам медом не казалась, им в компанию добавили вещество, именуемое ионообменником. Дело в том, что ионы одного знака заряда не могут вот так запросто войти в полимер. Им нужна подруга жизни противоположного знака заряда - т.н. противоион, ибо кусочек полимера обязан оставаться электронейтральным. Ионобменник состоит из двух ионов - большого и маленького. Большой ион хорошо растворим в полимере и никуда вылезать не собирается. Маленький же ион может с легкостью обмениваться с ионами в водном растворе.
Таким образом, на одно место в ионобменнике в полимере претендуют водород и, скажем, калий. Кого больше в водном растворе, тот и победил. Вы, наверно, помните, что если победит водород, мы это немедленно заметим по изменению окраски - сенсор посинеет. Если калия много, то водород пинками будет выгнан из полимера, и мы увидим, как сенсорная пленка розовеет. Осталось сделать активность водорода в водном растворе постоянной с помощью буферного раствора и - вуаля, можно калибрoвать сенсор на калий! Такой сенсор назвали оптодом (optode or bulk optode) и поначалу делали в виде пленки, у которой мерили оптическоe пропускание. Довольно быстро стало понятно, что полимер можно намазать на кончик световода и работать с флуоресценцией, подняв таким образом чувствительность и уменьшив объем пробы.
Но нет предела совершенству! Через несколько лет Эрик Баккер из Auburn University додумается сделать оптоды в виде маленьких шариков диаметром в десятки и единицы микрон. Сначала Шейн Пепер сварит их, используя эмульсионную полимеризацию. Потом Мартин Telting-Diaz будет делать их, используя нестабильность струи полимерного раствора - шарики будут получаться почти одинаковые. Резкое сокращение размеров сенсора сильно уменьшит время отклика, определяемого диффузией ионов внутри полимера. Следующий шаг сделают в лаборатории Рауля Копельмана в University of Michigan. Модифицировав метод эмульсионной полимеризации, исследователи смогли получить шарики диаметром в доли микрона. Такие шарики вполне можно ввести в клетку и глядеть на них в микроскоп, лучше всего в конфокальный. Что и будет с успехом продемострировано на макрофагах и раковых клетках. Макрофаги кушали сенсоры сами вследствие собственной прожорливости; в другие клетки сенсоры загоняли инъекцией и даже используя генную пушку (gene gun). Такие оптоды имеют огромное преимущество перед микроэлектродами вследствие ничтожно малого занимаемого объема клетки (0.5%) и эффективной изоляции чувствительных компонентов от внутриклеточной среды. И волки сыты, и овцы целы.
Но студенты и постдоки из группы Копельмана на этом не остановятся. Введя в матрицу полимера магнитные наночастицы и покрыв шарики С ОДНОЙ стороны тонким слоем металла, они станут вращать шарики магнитом, заставляя их мерцать в поле микроскопа. Модулированный сигнал гораздо легче отфильтровать от фона (backgroung fluorescence). Фильм, снятый учеными и продемострированный на Питтсбургской конференции по аналитической химии в 2003 году, был настолько впечатляющ, что автор, тогдашний постдок в группе Эрика Баккера из Auburn University, загорелся идеей что-нибудь такое с этими сенсорами сделать.
Одним из направлений развития оптодов, которое, возможно, приведет к расширению возможностей их применения, является использование фотохимических процессов для контроля химии сенсора. Введя фотохимический генератор кислоты в обычный оптод, автор еастоящей статьи получил сенсор, который был не только pH-чувствительным, но еще и позволял титровать пробу, определяя ее буферную емкость.
Для справки: "молчаливый наблюдатель", такой как оптод или стеклянный электрод, никогда не даст информации о полной концентрации кислоты или основания. Таким образом изменение концентрации буфера останется незамеченным. "Активный" сенсор еще и оттитрует пробу. Пока такой сенсор существуют в виде пленки в несколько микрон толщиной, но эксперименты идут над полимерными наношариками, пригодными для внутриклеточных измерений. Поживем - увидим...
- Bakker, E.; Buhlmann, P.; Pretsch, E., Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem. Rev. 1997, 97, 3083-3132.
- Buhlmann, P.; Pretsch, E.; Bakker, E., Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 2. Ionophores for Potentiometric and Optical Sensors. Chem. Rev. 1998, 98, 1593-1687.
- AMMANN, D. (1986). Ion-selective Microelectrodes. Principles, Design and Application. New York: Springer-Verlag
- Morf, W. E.; Seiler, K.; Rusterholz, B.; Simon, W., Design of a Calcium-Selective Optode Membrane Based on Neutral Ionophores. Anal. Chem. 1990, 62, 738.
- Shortreed, M.; Bakker, E.; Kopelman, R., Miniature Sodium-Selective Optode with Fluorescent pH Chromoionophores and Tunable Dynamic Range. Anal. Chem. 1996, 68, 2656-2662.
- Tsagkatakis, I.; Peper, S.; R, R.; Bell, M.; Bakker, E., Monodisperse Plasticized Poly(vinyl chloride) Fluorescent Microspheres for Selective Ionophore-Based Sensing and Extraction. Anal. Chem. 2001, 73, (24), 6083-6087
- Telting-Diaz, M.; Bakker, E., Mass-Produced Ionophore-Based Fluorescent Microspheres for Trace Level Determination of Lead Ions. Anal. Chem. 2002, 74, 5251-5256
- Buck, S. M.; Koo, Y. E. L.; Park, E.; Xu, H.; Philbert, M. A.; Brasuel, M. A.; Kopelman, R., Optochemical nanosensor PEBBLEs: photonic explorers for bioanalysis with biologically localized embedding. Current Opinion In Chemical Biology 2004, 8, (5), 540-546.
- Buck, S. M.; Xu, H.; Brasuel, M.; Philbert, M. A.; Kopelman, R., Nanoscale probes encapsulated by biologically localized embedding (PEBBLEs) for ion sensing and imaging in live cells. Talanta 2004, 63, (1), 41-59.
- Aspherical MagMOONs (Magnetically Modulated Optical Nanoprobes), J. Anker, C. Behrend and R. Kopelman, J. App. Phys. 93, 6698-6700 (2003).
- Shvarev, A., Photoresponsive Ion-Selective Optical Sensor. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, (22), 7138-7139.
