Нанотехнологическое сообщество Нанометр, все о нанотехнологиях
на первую страницу Новости Публикации Библиотека Галерея Сообщество Объявления Олимпиада ABC О проекте
 
  регистрация
помощь
 
Какая-то клеточка в разрезе

Все, что вы хотели знать о наносенсорах, но боялись спросить...

Ключевые слова:  внутриклеточные измерения, микроэлектроды, периодика, сенсоры

Автор(ы): Шварев Алексей

Опубликовал(а):  Шварев Алексей кубический медведь

20 декабря 2007

Живая клетка - один из самых интересных объектов для исследования. Неудивительно, что научная братия достаточно давно начала придумывать разные хитрые инструменты для того чтобы залезть внутрь этой самой клетки и чего-нибудь там померить. И желательно, чтобы ни клетка, ни инструмент при этом не поломались.

В этой статье автор попытается рассказать об оптических сенсорах для внутриклеточных измерений, при этом не о всяких, а о достаточно ограниченном классе оптических ион-селективных сенсоров. Поэтому название статьи не надо рассматривать очень серьезно, ибо химические сенсоры весьма многообразны и описать их достаточно полно в одной статье ну никак не получится.

Почему ион-селективные? Как было установлено достаточно давно, электролиты играют огромную роль в различных процессах в живых организмах. К примеру, наш мозг - это такой ионный аналоговый компьютер, в котором электроны заменены на ионы калия и натрия. Тонкий баланс концентраций электролитов внутри и снаружи клеток нашего (и не только нашего) организма поддерживается целой системой сложных процессов ввода-вывода веществ. Между прочим, смертельные инъекции приговоренным к смертной казни в Штатах делаются хлоридом калия. Повышение содержания калия в крови вызывает немедленную остановку сердечной деятельности.

Активный и пассивный трансмембранный транспорт таких ионов как водород, калий, натрий, кальций и хлорид изучается в течение долгого времени. Совсем недавно ученые начали осознавать также роль траспорта таких ионов металлов, как медь и цинк. Дело в том, что медь, например, токсична, но клетке она нужна. Как быть? Ион металла можно сделать "невидимым", связав его в комплекс. Так и делают белки - переносчики ионов металлов. При этом необходимо суметь его вовремя передать по эстафете другому белку. Как белки это делают, где происходит передача и аккумулирование ионов металлов - до сих пор не очень понятно.

Одним из первых, кто понял роль электролитов в живых системах, был датский химик Соренсен, который ввел понятие pH, ввел шкалу pH, и предложил способы измерения этого самого пэАШ. Для справки - пэАШ это отрицательный логарифм активности ионов водорода; почему активности , а не концентрации - об этом позже. Способов, предложенных Соренсеном в далеком 1909, было два. Первый был основан на наборе цветных индикаторов, второй - на измерении разности потенциалов, возникающей на поверхности стеклянной мембраны, позже ее назовут стеклянным электродом. Честь изобретения стеклянного электрода принадлежит Кремеру.


Стеклянный pH-электрод, собственно, и стал первым и самым старым химическим сенсором. С развитием электроники стало возможным сравнительно просто делать высокоомные вольтметры, и пАШ-метр стал неотъемлемой частью химической лаборатории и производства. Мой пАШ-метр даже запускает Internet Explorer и позволяет лазать по Cети, наигрывая mp3 файлы.

Изучая разность потенциалов на мембранах, сделанных из разных материалов, ученые быстро пополнили семейку электродов электродами на ионы галогенов, натрия, серебра, кадмия. В 60-х годах было сделано еще одно важное открытие. Оказалось, что мембрану можно делать жидкой и растворять в ней вещества, селективно связывающие определенные ионы, т.н. ионные переносчики или ионофоры. Первым был натуральный ионофор - антибиотик валиномицин. Позже мембрану сделают из пластифицированного полимера, прилично улучшив ее механические свойства. Огромное преимущество таких электродов заключалось в практически бесконечных возможностях изменения состава мембраны. В швейцарской лаборатории Вилли Симона довольно быстро наварили целую кучу синтетических ионофоров. Сегодня известны ионофоры, селективные примерно к 60 различным ионам.

Вернемся к нашим баранам, то есть к измерениям в клетке. Довольно быстро стало понятно, что ионоселективный электрод (ИСЭ) можно сделать тонким и с острым кончиком диаметром в доли микрона. Нанотехнологий в 60-х годах не было, поэтому такие электроды получили название "микроэлектроды". Их можно было воткнуть в клеточную стенку и измерять активность ионов внутри.

Что-же такое активность? Видите ли, физхимики люди весьма наивные и ленивые. Они думают, что наш мир линеен. Давление пара над раствором прямо пропорционально концентрации растворенного вещества, температуры кипения и замерзания также линейно зависят от состава раствора, и так далее. Потенциал ИСЭ, как выяснилось, линейно зависит от логарифма концентрации иона. Но дудки! Наш мир неидеален, и от линейности происходят отклонения, увы и ах! Что делают ленивые физхимики? Эти наивные люди по - прежнему утверждают, что параметры системы линейно зависят, но... не от концентрации, а от активности. Введя поправочную функцию, именуемую коэффициентом активности, физхимики заваливаются обратно в спячку.

Иными словами, наш "линейный" мембранный электрод измеряет не концентрацию, а активность (кажущуюся концентрацию). Чем выше концентрация электролита, тем более выраженным становится отклонение. И именно эта особенность стала огромным преимуществом ИСЭ перед другими методами анализа. Потому что в живой клетке протекающие процессы контролирует активность, а не концентрация. Для справки: в США производят ежегодно примерно 300 миллионов определения активности калия в крови тем самым валиномициновым электродом.

Изваяв микроэлектроды, исследователи начали с энтузиазмом втыкать их в живые клетки. Единственная проблема заключалась в том, что электрод все-таки повреждал клеточную стенку и занимал довольно много места внутри клетки (до 30% объема). Помните Соренсена и его набор индикаторов? Синтезировав молекулу, избирательно связывающую определeнный ион и при этом меняющую оптические свойства, мы можем ввести ее в клетку. Посмотрев на покрашенную таким красителем клетку в микроскоп, мы можем судить о распределении того или иного иона в цитоплазме. Одним из известных производителей подобных индикаторов стала фирма Molecular Probes, основанная в Юджине, штат Орегон. Неудивительно, что один из красителей называется Орегонский Зеленый.

Но с индикаторами другая проблема: во-первых, клетке может не понравится, что в нее ввели какое-то вещество в приличной концентрации. Во-вторых, содержимое цитоплазмы может запросто начать реагировать с красителем. Тот самый Вилли Симон в 70-х предложил концепцию оптического ион-селективного сенсора. Как он устроен? Очень просто. Это кусочек полимера, в котором растворили ДВА ионофора. Один селективен к ионам, скажем, металла, а другой - к ионам водорода. Только вот этот второй ионофор еще и меняет оптические свойства при связывании иона водорода, совсем как лакмусовая бумажка. Чтобы служба ионофорам медом не казалась, им в компанию добавили вещество, именуемое ионообменником. Дело в том, что ионы одного знака заряда не могут вот так запросто войти в полимер. Им нужна подруга жизни противоположного знака заряда - т.н. противоион, ибо кусочек полимера обязан оставаться электронейтральным. Ионобменник состоит из двух ионов - большого и маленького. Большой ион хорошо растворим в полимере и никуда вылезать не собирается. Маленький же ион может с легкостью обмениваться с ионами в водном растворе.

Таким образом, на одно место в ионобменнике в полимере претендуют водород и, скажем, калий. Кого больше в водном растворе, тот и победил. Вы, наверно, помните, что если победит водород, мы это немедленно заметим по изменению окраски - сенсор посинеет. Если калия много, то водород пинками будет выгнан из полимера, и мы увидим, как сенсорная пленка розовеет. Осталось сделать активность водорода в водном растворе постоянной с помощью буферного раствора и - вуаля, можно калибрoвать сенсор на калий! Такой сенсор назвали оптодом (optode or bulk optode) и поначалу делали в виде пленки, у которой мерили оптическоe пропускание. Довольно быстро стало понятно, что полимер можно намазать на кончик световода и работать с флуоресценцией, подняв таким образом чувствительность и уменьшив объем пробы.

Но нет предела совершенству! Через несколько лет Эрик Баккер из Auburn University додумается сделать оптоды в виде маленьких шариков диаметром в десятки и единицы микрон. Сначала Шейн Пепер сварит их, используя эмульсионную полимеризацию. Потом Мартин Telting-Diaz будет делать их, используя нестабильность струи полимерного раствора - шарики будут получаться почти одинаковые. Резкое сокращение размеров сенсора сильно уменьшит время отклика, определяемого диффузией ионов внутри полимера. Следующий шаг сделают в лаборатории Рауля Копельмана в University of Michigan. Модифицировав метод эмульсионной полимеризации, исследователи смогли получить шарики диаметром в доли микрона. Такие шарики вполне можно ввести в клетку и глядеть на них в микроскоп, лучше всего в конфокальный. Что и будет с успехом продемострировано на макрофагах и раковых клетках. Макрофаги кушали сенсоры сами вследствие собственной прожорливости; в другие клетки сенсоры загоняли инъекцией и даже используя генную пушку (gene gun). Такие оптоды имеют огромное преимущество перед микроэлектродами вследствие ничтожно малого занимаемого объема клетки (0.5%) и эффективной изоляции чувствительных компонентов от внутриклеточной среды. И волки сыты, и овцы целы.

Но студенты и постдоки из группы Копельмана на этом не остановятся. Введя в матрицу полимера магнитные наночастицы и покрыв шарики С ОДНОЙ стороны тонким слоем металла, они станут вращать шарики магнитом, заставляя их мерцать в поле микроскопа. Модулированный сигнал гораздо легче отфильтровать от фона (backgroung fluorescence). Фильм, снятый учеными и продемострированный на Питтсбургской конференции по аналитической химии в 2003 году, был настолько впечатляющ, что автор, тогдашний постдок в группе Эрика Баккера из Auburn University, загорелся идеей что-нибудь такое с этими сенсорами сделать.

Одним из направлений развития оптодов, которое, возможно, приведет к расширению возможностей их применения, является использование фотохимических процессов для контроля химии сенсора. Введя фотохимический генератор кислоты в обычный оптод, автор еастоящей статьи получил сенсор, который был не только pH-чувствительным, но еще и позволял титровать пробу, определяя ее буферную емкость.

Для справки: "молчаливый наблюдатель", такой как оптод или стеклянный электрод, никогда не даст информации о полной концентрации кислоты или основания. Таким образом изменение концентрации буфера останется незамеченным. "Активный" сенсор еще и оттитрует пробу. Пока такой сенсор существуют в виде пленки в несколько микрон толщиной, но эксперименты идут над полимерными наношариками, пригодными для внутриклеточных измерений. Поживем - увидим...

  • Bakker, E.; Buhlmann, P.; Pretsch, E., Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem. Rev. 1997, 97, 3083-3132.
  • Buhlmann, P.; Pretsch, E.; Bakker, E., Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 2. Ionophores for Potentiometric and Optical Sensors. Chem. Rev. 1998, 98, 1593-1687.
  • AMMANN, D. (1986). Ion-selective Microelectrodes. Principles, Design and Application. New York: Springer-Verlag
  • Morf, W. E.; Seiler, K.; Rusterholz, B.; Simon, W., Design of a Calcium-Selective Optode Membrane Based on Neutral Ionophores. Anal. Chem. 1990, 62, 738.
  • Shortreed, M.; Bakker, E.; Kopelman, R., Miniature Sodium-Selective Optode with Fluorescent pH Chromoionophores and Tunable Dynamic Range. Anal. Chem. 1996, 68, 2656-2662.
  • Tsagkatakis, I.; Peper, S.; R, R.; Bell, M.; Bakker, E., Monodisperse Plasticized Poly(vinyl chloride) Fluorescent Microspheres for Selective Ionophore-Based Sensing and Extraction. Anal. Chem. 2001, 73, (24), 6083-6087
  • Telting-Diaz, M.; Bakker, E., Mass-Produced Ionophore-Based Fluorescent Microspheres for Trace Level Determination of Lead Ions. Anal. Chem. 2002, 74, 5251-5256
  • Buck, S. M.; Koo, Y. E. L.; Park, E.; Xu, H.; Philbert, M. A.; Brasuel, M. A.; Kopelman, R., Optochemical nanosensor PEBBLEs: photonic explorers for bioanalysis with biologically localized embedding. Current Opinion In Chemical Biology 2004, 8, (5), 540-546.
  • Buck, S. M.; Xu, H.; Brasuel, M.; Philbert, M. A.; Kopelman, R., Nanoscale probes encapsulated by biologically localized embedding (PEBBLEs) for ion sensing and imaging in live cells. Talanta 2004, 63, (1), 41-59.
  • Aspherical MagMOONs (Magnetically Modulated Optical Nanoprobes), J. Anker, C. Behrend and R. Kopelman, J. App. Phys. 93, 6698-6700 (2003).
  • Shvarev, A., Photoresponsive Ion-Selective Optical Sensor. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, (22), 7138-7139.


В статье использованы материалы: Sharev


Средний балл: 7.0 (голосов 9)

 


Комментарии
Спасибо за ведение дискуссии в максимально корректной и интересной форме - в виде статей, адрессованных и бывшим оппонентам, и читателям
Действительно очень познавательно. Спасибо.
Кстати, Алексей, хотел давно спросить, а как обстоят дела с измерениями в растительной клетке с ее толстой клеточной стенкой?
Шварев Алексей, 20 декабря 2007 12:21 
В принципе ничто не мешает использовать прямую инъекцию. Копельмановские аспиранты умудрялись "воткнуть" около 10 пиколитров раствора сенсоров в клетку.
Гольдт Илья Валерьевич, 20 декабря 2007 12:44 
А у меня вопрос по поводу "труднойстей перевода".
Как правильно по русски "ион-селективный" или "ионоселективный"?
Например, не пишут же "ион-селективный электрод", а пишут "ионоселективный электрод"
Шварев Алексей, 20 декабря 2007 12:47 
А бес его знает, надо дисер посмотреть... Но поймут вас в любом случае..
Бурнин Андрей, 20 декабря 2007 21:47 
По поводу использования дефисов в номенклатуре
http://pubs....verbox.html
Dispute Over Crystal Structure Nomenclature Takes Center Stage.
Ann M. Thayer
At a recent international conference on crystallization, participants spent some time discussing the chemical definitions of and appropriate terminology for multicomponent crystals. "It was probably one of the low points of my career," one attendee tells C&EN, "when we spent 30 minutes arguing whether the word should be spelled co-crystal or cocrystal."

Илья Валерьевич, еще как пишут - но, похоже, и здесь однозначной терминологии нам не дождаться. Если взять на вооружение творческий метод одного из предыдущих докладчиков, то получится, что Гугл выдает 1160 ссылок на "ион-селективный" и "ионселективный", которые он не различает, и 1870 ссылок на "ионоселективный" - хотя мне, например, не нравится как раз "ионоселективный".
Интересные факты.
Шварев Алексей, можете ли вы рассказать о микроэлектродах чуть подробней, или хотя бы дать литературные источники. заранее спасибо
Может.
Только здесь Алексей появляется сейчас исключительно редко.
Так что конкретные вопросы адресуйте на его е-meil.
и какой же у него e-mail.
Трусов Л. А., 07 марта 2011 14:19 
у него в профиле написан
профиль не открывается, ошибка вылазиет, скажите если не сложно
Трусов Л. А., 07 марта 2011 16:20 
alexey.shvarev(а)oregonstate.edu

раньше такой был
спасибо

Для того чтобы оставить комментарий или оценить данную публикацию Вам необходимо войти на сайт под своим логином и паролем. Зарегистрироваться можно здесь

 

Червячки
Червячки

4 февраля объявили лауреатов V Всероссийской премии «За верность науке»
4 февраля в здании Минобрнауки РФ состоялась торжественное награждение лауреатов V Всероссийской премии «За верность науке». 11 научно-просветительских проектов были отмечены престижной наградой.

Всероссийский съезд учителей и преподавателей химии
5 февраля в Московском университете в Шуваловском корпусе МГУ состоится Всероссийский съезд учителей и преподавателей химии, посвященный Международному году Периодической таблицы химических элементов, начало - 10 часов.

II Всероссийский химический диктант пройдет 18 мая 2019 года
В 2019 году периодическому закону Дмитрия Менделеева исполнится 150 лет! В честь великого открытия этот год объявлен Международным годом Периодической таблицы химических элементов. Одним из наиболее ярких событий, приуроченных к этому году, станет II Всероссийский химический диктант, который пройдет 18 мая и который в этом году выходит на международный уровень. Мероприятие было анонсировано в рамках церемонии открытия Международного года Периодической таблицы химических элементов 29 января 2019 года в Париже, в штаб-квартире ЮНЕСКО.

Самые необычные таблицы Менделеева на выставке Международного года Периодической таблицы химических элементов

6-8 февраля в Российской академии наук состоялось торжественное открытие Международного года периодической таблицы химических элементов в России и приуроченная к этому масштабная интерактивная выставка

Почувствовать живое...
Е.А.Гудилин, А.А.Семенова, Н.А.Браже
Неразрушающее исследование живых клеток и клеточных структур является в настоящее время важным направлением научных изысканий, которые во многих зарубежных и российских научных группах направлены на достижение вполне прагматической цели – разработку новых принципов биомедицинской диагностики и эффективных подходов в нарождающейся персональной медицине.

Российская газета: Перевернуть пирамиду. Президент РАН: как повысить наши шансы на Нобеля
Юрий Медведев
Почему Россия по числу Нобелей отстает от ведущих стран мира, уступая, например, даже маленькой Швейцарии? Замалчиваются ли достижения отечественных ученых? Почему без привлечения в науку российского бизнеса мы не сможем успешно конкурировать в борьбе за престижную научную премию? Об этом корреспондент "РГ" беседует с президентом РАН Александром Сергеевым, который побывал в Стокгольме на вручении Нобелевских премий и поделился своими впечатлениями.

Инновационные системы: достижения и проблемы
Олег Фиговский, Валерий Гумаров

Технопредпринимательство на марше

Мы традиционно просим вас высказать свои краткие суждения по вопросу технопредпринимательства и проектной деятельности школьников. Для нас очевидно, что под технопредпринимательством и под проектной деятельностью школьников каждый понимает свое, но нам интересно ваше мнение, заодно вы сможете увидеть по мере прохождения опроса, насколько оно совпадает или отличается от мнения остальных. Ждем ваших ответов!

О наноолимпиаде замолвите слово...

Прошла XII Всероссийская олимпиада "Нанотехнологии - прорыв в Будущее!" Мы надеемся, что нам для улучшения организации последующих наноолимпиад поможет электронное анкетирование. Мы ждем Ваших замечаний, пожеланий, предложений. Спасибо заранее!

Опыт обучения в области нанотехнологического технопредпринимательства

В этом опросе мы просим поделиться опытом и Вашим отношением к нанотехнологическому технопредпринимательству и смежным областям. Заранее спасибо за Ваше неравнодушие!



 
Сайт создан в 2006 году совместными усилиями группы сотрудников и выпускников ФНМ МГУ.
Сайт модернизирован для ресурсной поддержки проектной деятельности учащихся в рамках ГК 16.647.12.2059 (МОН РФ)
Частичное или полное копирование материалов сайта возможно. Но прежде чем это делать ознакомьтесь с инструкцией.